| 【血清測定には限外濾過による前処理が必要です】 |
| ELISAキットは血清高分子（蛋白質と推定）により正の干渉を受けます。 そのため血清サンプルおよび、
蛋白質の混入の可能性の高い異常尿の測定時には、前処理として限外濾過による 高分子成分の除去が必要となります。 |
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| 【実施例】 |
| 私共では限外濾過フィルターとして、日本ミリポア社 Microcon YM-10(catalog#42407)を使用しております。
これは分画分子量1万Daの“エッペンチューブ”型の遠心方式の限外濾過フィルターです。血清300μLをフィルターに分注し、1万Gにて40〜50分程度
遠心して頂くと200μL程度の濾液が得られます。この濾液をそのまま、あるいはPBS(pH7.4)にて数倍に希釈して 「高感度8-OHdG Check
（商品コード：KOG-HS10）」にて測定できます。濾液の測定値がそのまま血清中の8-OHdGの測定値となります。 |
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日本ミリポア社 Microcon YM-10を準備します。 |
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蒸留水に8時間程度浸し洗浄。
※気泡が入らないようご注意ください。
※YM-10以外の限外濾過フィルターをご利用の場合は、取扱説明書に従って洗浄操作を実施してください。 |
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フィルターに付着した水滴を除去します。
フィルターが乾かないうちに蒸留水を300μL分注します。 |
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10,000Gにて20℃20分遠心して、蒸留水を通過させフィルター洗浄します。 |
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フィルターユニットを上下反転してセットします。 |
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軽く遠心をして、フィルターユニット内部の水滴を除去します（1,000G*3分20℃）。 |
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血清/血漿を300μL分注します。
※300μL以上入れると、ローターの角度によっては、血清/血漿原液が壁面を伝って濾液側に混入する場合があります。
※フィルターの洗浄からサンプル分注までの間にフィルターを乾かさないようご注意ください。 |
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20℃にて10,000G*50分間 遠心します。
150〜200μLの濾液が得られます。
※遠心中に温度が上昇するようでしたら、冷却機能付きの遠心機をご使用ください。 |
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濾液（フィルター通過画分）をそのまま、又はPBSにて2倍希釈して「高感度8-OHdG Check」にて測定してください。 |
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| 【サンプリング上の注意点】 |
採血後は出来るだけ速やかに血球分離を行ってください。血液中の白血球が活性化されると活性酸素を多量に放出する場合があり、8-OHdG値を上昇させる可能性があります。ヒト血清の場合には、採血後20分以内に遠心（3000rpm・15分・室温）を開始することをお勧めします。
血清/血漿サンプルは-20℃以下で凍結保存とし、凍結融解の繰り返しは避けてください。
限外濾過による高分子成分の除去処理は測定直前に実施するようにしてください。 |
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| 【ヒト以外の動物血清および特殊検体への適用について】 |
尿以外のサンプル、ヒト以外の動物血清などへの適用につきましては、正確な測定値が得られているか、検証作業を個別に実施されることをお奨めします。具体的には、測定対象に既知量の精製8-OHdG（キットに添付の標準物質）を添加して、添加した量に対する、測定値としての回収率（いわゆる添加回収試験）により評価します。
添加回収率＝（ 添加後の測定値-添加前の測定値）÷サンプルに添加した8-OHdG濃度
添加回収率が100％付近であれば、正常に検出できていると考えられますが、異常な場合には200％などの添加回収率を示す場合があります。このような場合の対処法として、サンプルをPBSにて希釈すると正常に検出できるようになる場合がありますのでご検討ください。 |
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| 【添加回収試験の実施例】 |
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| 【トラブルシューティング】 |
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添加回収率が100±20％から大きく外れる場合には、血清/血漿サンプルを限外濾過したのち、PBS(pH7.4)にて2〜4倍希釈して、再度ご検討ください。殆どのケースでは希釈によって正常に測定できるようになります。 |
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ELISAでの測定時にはバラツキを抑えるためにN=3以上での測定をお奨めします。 |
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| 【参考値】 |
0.1〜0.3 ng/mL（ヒト健常者・社内データ）、0.7 ng/mL（ヒト腎臓疾患）
※ヒト血清中の8-OHdG濃度は非常に低く、健常者血清では検出下限以下なる場合もあります。 |
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| 【参考文献】 |
| 1) |
Suzuki K, et. al.: The relationship between smoking habits and serum levels of 8-OHdG, oxidized LDL antibodies, Mn-SOD and carotenoids in rural Japanese residents. J Epidemiol 2003 Jan;13(1):29-37 （ ELISAキットによるヒト血清測定例） |
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