日本老化制御研究所酸化ストレスマーカー：グルタチオン測定キット

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Rev.080508

グルタチオン測定キット
Colorimetric assay kit for total glutathione (GSH + GSSG).

（本製品は研究用試薬です。）

【細胞内の主要な抗酸化成分】

グルタチオン（glutathone: GSH: γ-glutamylcysteinylglycine）はペプチド性のチオールであり、細胞内の主要な抗酸化成分です。細菌からヒトに至るまで普遍的に存在し、ヒドロペルオキシドのアルコールへの還元反応、過酸化水素の水への還元反応において電子供与体として機能するほか、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ等の酵素の補因子としての機能が知られており、また様々な毒物/薬物等の細胞外への排出機構、抗酸化防御、放射線防護、蛋白質フォールディングの促進に関わっていることが知られています。

本製品は動物および植物由来のサンプル中のトータルグルタチオン（酸化型 + 還元型）を測定するキットです。サンプル中のグルタチオンは、DNTB (5-5'-dithiobis[2-nitrobenzoic acid])と反応して412nmの吸収を持つTNB (5-thiobenzoic acid)と GS-TNBを形成します。GS-TNBはグルタチオン還元酵素によるサイクル反応によりTNBとGSHに分解され、このGSHはふたたびDNTBと反応してTNBを生成します（左下図）。412nm（または405nm）の吸光度変化を計測することで、高感度にグルタチオンを検出できます。
また、サンプルを予め4-vinylpyridineで処理することで、酸化型グルタチオン(GSSG)のみを検出することも可能です。

【製品仕様】

● 測定対象：	全血、血漿、組織ホモジネート、培養細胞など
● 測定レンジ：	0.1～20μmol/L
● 所要時間：	約15分
● サンプル所要量：	50μL
● テスト数：	96wells * 2枚（N=2のとき90サンプル）
● 必要な器具：	405nmの経時変化を測定できるマイクロプレートリーダー（15～20秒間隔で3分間計測できるもの）、マイクロピペット（25/50/100/500μL）、マルチチャネルピペット、25～50mLビーカー、蒸留水、エッペンドルフチューブまたは遠心管、 metaphosphoric acid（SIGMA 239275または相当品。サンプルの除蛋白処理をする場合のみ）
● 保存条件：	冷蔵（2～10℃ ・凍結不可）

【サンプルの前処理】

	サンプル中に含まれる蛋白質や酵素は、グルタチオン測定に影響を与える場合があります。このような場合は下記の手順にて除蛋白処理をすることをお奨めします。また、この除蛋白処理は、酸性条件下にて行われるため、サンプル中のグルタチオンを安定化する効果もあります。
1.	5％ MPA(metaphosphoric acid)水溶液を調製します。MPA 1gを蒸留水20mLに溶解します。調製後は2～8℃にて保存し、当日中に使用します。
2.	遠心管またはエッペンチューブに、サンプル50μLを分注します。
3.	5％ MPA水溶液（冷）を100μL添加し、ボルテックスにて5秒間攪拌します。
4.	1000 xGにて5分間遠心し、上清を回収します。
5.	上清をアッセイバッファーにて20倍以上に希釈して測定します。当日測定しない場合には上清を-20℃にて凍結保存します。
	【血液サンプルの場合】抗凝固剤にEDTA、ヘパリン、クエン酸を使用できます。保存は冷蔵（2～8℃）とし凍結しないようにご注意ください。除蛋白処理をしてから測定します。血漿中のグルタチオン濃度は低いため、高感度プロトコルを用いて測定します。
	【組織サンプルの場合】生理的リン酸緩衝液等を用いて10%(w/v)ホモジネートを調製し、遠心上清を回収します。組織ホモジネート中のグルタチオンは代謝酵素等の影響により失われやすいため、氷冷し、直ちに除蛋白処理をします。補正には、出発材料となる組織の湿重量または組織ホモジネートの蛋白濃度が用いられます。尚、組織中の血液にもグルタチオンが含まれるため、必要に応じてヘパリンを含む生理的リン酸緩衝液等で灌流処理します。
	【培養細胞の場合】 10⁶ cells/mLの細胞懸濁液をホモジナイズまたはソニケーションにより可溶化処理を行います。遠心上清を回収します。細胞懸濁液中のグルタチオンは代謝酵素等の影響により失われやすいため、氷冷し、直ちに除蛋白処理をします。補正には細胞数または細胞可溶化液中の蛋白濃度が用いられます。培養細胞中のグルタチオン量は実験条件により大きく異なるため、必ず予備実験をして測定レンジに収まることを確認してください。

【測定手順】

1.	使用する試薬を室温に戻し、必要に応じてサンプルの前処理を実施します。サンプルの希釈にはアッセイバッファーを使用します。
2.	マイクロプレートに、キャリブレーター/サンプルを50μL/ウェル分注します。
3.	全てのウェルにDTNB試薬を50μL添加します。
4.	全てのウェルにグルタチオン還元酵素を50μL添加、混合します。
5.	室温にて3～5分インキュベートします。
6.	全てのウェルにNADPH試薬を50μL分注します。
7.	405nmにおける吸光度を15～20秒間隔で3分間測定します。
8.	キャリブレーター、サンプルについて、405nmにおける吸光度変化率（ΔA_405nm/min）を算出し、左下図のように検量線を作成します。
9.	サンプル中のグルタチオン濃度を算出します。20μmol/L以上となった場合は、アッセイバッファーにて希釈してから測定してください。検出限界以下（＜0.1μmol/L）のサンプルにつきましては高感度プロトコルにて検出できる場合があります。

【キットの構成】

1.	マイクロプレート	96wells * 2枚
2.	NADPH	2本。NADP溶解液を全量添加して溶解します。冷蔵にて1週間、-20℃にて6週間使用可能です。
3.	NADPH溶解液	6mL * 2本。NADPHの溶解に使用します。
4.	DTNB試薬	11mL * 1本。そのまま使用します。
5.	グルタチオン還元酵素	11mL * 1本。そのまま使用します。
6.	キャリブレーター(GSSG)	GSH=400μM相当 0.5mL * 1本。アッセイバッファーにて20倍および40倍に希釈して 20μM GSH、10μM GSHを調製します。0μM GSHにはアッセイバッファーをそのまま使用します。
7.	アッセイバッファー	125mL * 1本。そのまま使用します。

【参考文献】

1)	Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues. Anal Biochem. 27(3), p502-522 (1969) Tietze F.

品名	商品コード	測定波長	所要時間	希望小売価格
グルタチオン測定キット	KGS-001W	405nm kinetics	約15分	52,500円（税抜 50,000円）

【製造元】：Northwest Life Science Specialities LLC, USA

【ご注意】

弊社の提供する試薬、受託分析サービス等は全て研究用です。研究以外の用途（臨床検査/診断/医療行為等）には使用できません。

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日本老化制御研究所 Japan Institute for the Control of Aging (JaICA), Nikken SEIL Co., Ltd.