| ホーム > 酸化ストレスマーカー技術情報（ページ １／
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こちらでは酸化ストレスマーカーの技術情報、学術情報をご紹介しております。皆様のご研究に役立てて頂ければ幸いです。
またよろしければ、学会や論文等で発表された内容をご紹介頂ければ大変ありがたく思います。このページの一番下にお問い合わせフォームをご用意いたしました。ご質問・コメントなどお気軽にお送り頂けると助かります。対象となるマーカーも徐々に増やしていきたいと思います。どうぞよろしくお願い申し上げます。
弊社は本ホームページおよび製品、添付文書等を作成するにあたり細心の注意を払っておりますが、これらによる損害が万一発生した場合でも、弊社は責を負いませんので予めご了承ください。 |
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| 抗4-HNEモノクローナル抗体 |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
適用可能な動物種 |
ヒト、ウサギ、ラットなど幅広い動物種に適用可能です。
マウス組織への適用の際には、組織サンプル由来のマウスIgGへの対策が必要です。
例えばVector社Vector M.O.M. Immunodetection kit (code.PK2200・フナコシより入手可能)が利用可能と思われます。
マウスへの適用例をご存知の先生がいらっしゃいましたらご紹介頂けると大変助かります。
⇒ぜひbiotech@jaica.comまでご一報ください。 |
| 2 |
免疫組織染色プロトコル |
⇒詳細はこちらをご参照ください。
4-HNEは脂質酸化によって発生し、蛋白質中のLys/His/Arg残基に結合して、安定な付加体を形成します。抗4-HNEモノクローナル抗体（clone HNEJ-2）は主に4-HNEのLys付加体を認識いたします。染色部位は主に細胞質となりますが、サンプルによっては細胞核が染色される場合もあります。最近になって蛋白質だけでなくDNAも4-HNE修飾を受けることが報告されております。clone HNEJ-2は4-HNEのDNA付加体にも結合すると考えられます。 |
| 3 |
ウェスタンブロット |
抗4-HNE抗体はウェスタンブロットにも適用可能です。この場合には免疫組織染色の場合よりも低濃度（例：2.15 〜15 μg/mL）にて実施してください。
【参考文献】：
The monoclonal antibody specific for the 4-hydroxy-2-nonenal histidine adduct. FEBS Lett. Vol.359, p189-191 (1995), S Toyokuni, et. al.
【メモ】：
抗体の特異性データ、4-HNE-BSAコンジュゲートの調製⇒ウェスタンブロットの実施例が掲載されております。 |
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よろしければ質問・コメント・研究事例などお寄せください。 |
| 【参考文献】 |
| 1) |
S.Toyokuni, N.Miyake, H.Hiai, M.Hagiwara, S.Kawakishi, T.Osawa and K.Uchida:
The monclonal antibody specific for the 4-hydroxy-2-nonenal histidine adduct.
FEBS Lett. 359, p189-191 (1995) |
| 2) |
T.Tanaka, Y.Nishiyama, K.Okada, K.Hirota, M.Matsui, J.Yodoi, H.Hiai, and S.Toyokuni:
Induction and nuclear translocation of thioredoxin by oxidative damage in the mouse kidney: independence of tubular necrosis and sulfhydryl depletion.
Lab. Invest. 77(2), p145-155 (1997) |
| 3) |
Y.Hattori, C.Nishigori, T.Tanaka, K.Uchida, O.Nikaido, T.Osawa, H.Hiai, S.Imamura, and S.Toyokuni:
8-Hydroxy-2・deoxyguanosine is increased in epidermal cells of hairless mice after chronic ultraviolet B exposure.
J. Invest. Dermatol. 107, p733-737 (1997) |
| 4) |
S.Toyokuni:
Reactive oxygen species-induced molecular damage and its application in pathology.
Pathol. Internat. 49, p91-102 (1999) |
| 5) |
S.Kondo, S.Toyokuni, Y.Iwasa, T.Tanaka, H.Onodera, H.Hiai and M.Imamura:
Persistent oxidative stress in human colorectal carcinoma, but not in adenoma.
Free Rad. Biol. Med. 27, p401-410 (1999) |
| 6) |
T.D. Oberley, S.Toyokuni, and L.I.Szweda:
Localization of hydroxynonenal protein adducts in normal human kidney and selected human kidney cancers.
Free Rad. Biol. Med. 27, p695-703 (1999) |
| 7) |
Hiroko Kimura, Masahiro Mukaida, Kyoko Kuwabara, Teruyo Ito, Kimikazu Hashino, Koji Uchida, Kazuko Matsumoto and Ken-ichi Yoshida:
4-Hydroxynonenal modifies IgA in rat intestine after lipopolysaccharide injection.
Free Radical Biology and Medicine, 41(6), p973-978 (2006)
LPS刺激したラット腸において4-HNE修飾IgAが免疫学的に検出されています。 |
| 8) |
Zhang N, Komine-Kobayashi M, Tanaka R, Liu M, Mizuno Y, Urabe T:
Edaravone reduces early accumulation of oxidative products and sequential inflammatory responses after transient focal ischemia in mice brain.
Stroke. 36(10):p2220-2225(2005)
マウスに対し60分間虚血⇒再灌流処置。再灌流開始24ｈ/72ｈ/7日後の4-HNEを免疫組織染色にて測定。エダラボン投与penumbra 部における4-HNE修飾蛋白質は減少。 |
| 9) |
Fiorella Biasi, Barbara Vizio, Cinzia Mascia, Ezio Gaia, Neven Zarkovic, Elena Chiarpotto, Gabriella Leonarduzzi and Giuseppe Poli :
c-Jun N-terminal kinase upregulation as a key event in the proapoptotic interaction between transforming growth factor-β1 and 4-hydroxynonenal in colon mucosa
Free Radical Biology and Medicine 41(3), p443-454(2006)
4-HNEはJNK活性化によりアポトーシスを惹起する。 |
| 10) |
Isabella Dalle-Donne, Marina Carini, Giulio Vistoli, Luca Gamberoni, Daniela Giustarini, Roberto Colombo, Roberto Maffei Facino, Ranieri Rossi, Aldo Milzani and Giancarlo Aldini:
Actin Cys374 as a nucleophilic target of α,β-unsaturated aldehydes
Free Radical Biology and Medicine 42(5), p583-598(2007)
アクチンに対する4-HNE/Acrolein付加体形成は主にCys374を対象に起きる。 |
| 11) |
Shintaro Kodai, Shigekazu Takemura, Yukiko Minamiyama, Seikan Hai, Satoshi Yamamoto, Shoji Kubo, Yasukazu Yoshida, Etsuo Niki, Shigeru Okada, Kazuhiro Hirohashi, Shigefumi Suehiro:
S-allyl cysteine prevents CCl4-induced acute liver injury in rats.
Free Radical Research 41(4), p489-497(2007)
CCl4投与ラット肝のウェスタンブロット解析。28kD、46kD、50kDのバンドが検出されています。 |
| 12) |
Tai-Ho Hung, Jeremy N. Skepper, and Graham J. Burton:
In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury in Term Human Placenta as a Model for Oxidative Stress in Pathological Pregnancies.
American Journal of Pathology 159(3), p1031-1043(2001)
ヒト胎盤を対象とした研究例です。免疫組織染色とウェスタンブロットで4-HNEを検出しています。 |
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| ヘキサノイルリジン測定用ELISAキット |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
適用可能な動物種 |
ヒト、ウサギ、ラットなど幅広い動物種に適用可能と考えられます。2004/06時点ではヒト尿、イヌ尿、ネコ尿への 適用例があります。 ヘキサノイルリジンの研究事例をひろく集めて、皆様のご研究に役立てたいと考えております。
⇒ぜひ実験例をbiotech@jaica.comまでご一報ください。どうぞよろしくお願い申し上げます。 |
| 2 |
ヒト尿サンプルの
測定例（健常者） |
PBSにて4倍程度の希釈をお奨めします。
・尿中HEL濃度（105.4±67.0 nmol/L）
・尿中HEL濃度（85.1±61.8 pmol/mg CRE）クレアチニン補正
・尿中HEL濃度（77.2±54.9 pg/hour kg）生成速度補正 |
| 3 |
ヒト血清サンプルの
測定例（健常者） |
前処理（プロテアーゼ処理）を行うことで、血清中のHELを検出できます。
【測定手順】：
1) 血清サンプルをPBSにて2倍希釈します。
2) 希釈血清300μLに対しαキモトリプシン溶液（14mg/mL in PBS）60μL添加。
3) 37℃1晩インキュベート
4) 限外濾過膜（例：Millipore社Microcon YM10）を通過させる（プロテアーゼ除去）
5) 限外濾過の濾液をHEL測定ELISAキットにて測定
【参考値】：
健常者ヒト血清中HEL濃度 7.96±4.32 nmol/L |
| 4 |
動物由来サンプルの測定 |
・イヌ尿HEL：PBSにて4倍程度の希釈をお奨めします。参考値 14〜58 nmol/L
・ネコ尿HEL：PBSにて10倍程度の希釈をお奨めします。参考値 108〜298 nmol/L
・ラット血清HEL：ヒト血清と同様にプロテアーゼ処理して測定します。参考値 25.8 nmol/L |
| 5 |
酸化LDLの測定 |
精製ヒトLDLをin vitroにて酸化処理するとHELが検出されます。
【測定手順】：
1) 精製LDL画分または酸化LDLをPBS(pH7.4)に透析します。
2) サンプル100μLに対しTrypsin溶液100μL(40mg/mL)およびCaCl2水溶液(100mM)2μL添加。
3) 37℃1晩インキュベート
4) Microcon YM10にて限外濾過処理（Trypsin除去）
5) 限外濾過の濾液をHEL測定ELISAキットにて測定
【測定結果】：native human LDL=13.6 nmol/L, oxidized human LDL=363.6 nmol/L |
| 6 |
組織サンプルへの適用 |
組織中のHELをELISAにて測定した文献はまだ無いようですが、下記の方法にて測定できる可能性があります。是非お試しください。
【測定手順】：
1) 組織サンプルを0.1% BHT (butylated hydroxytoluene)を含むPBS中にホモジネート
2）遠心上清を回収し、可溶化画分とします
3) 可溶化画分300μLに対しαキモトリプシン溶液（14mg/mL in PBS）60μL添加。
4) 37℃1晩インキュベート
5) 限外濾過膜（例：Millipore社Microcon YM10）を通過させる（プロテアーゼ除去）
6) 限外濾過の濾液をHEL測定ELISAキットにて測定
※BHTは大変水に溶けにくいのでエタノール中に溶かしてからPBSに添加します。PBSや水に添加したときに濁りを生じる場合があります。この場合には、予めBHT/PBS溶液を作りおきするのではなく、ホモジネートを開始する 直前にBHTエタノール溶液を添加混合してそのまま 直ちにホモジネートを開始することをお奨めします。 |
| 7 |
培養細胞でのHEL定量 |
培養細胞中のHELにつきましては下記の方法にて測定できる可能性があります。是非お試しください。
【測定手順】：
1）コンフルエントに達するまで培養（6穴プレート）
2）無血清培地に置換し、酸化ストレス負荷
3）PBSにて3回洗浄
4）PBS 600μL中に、スクレイパーにて細胞を回収
5) 細胞懸濁液に0.1% BHT (butylated hydroxytoluene)を加え、ソニケーターにて破砕
6）遠心上清を回収し、可溶化画分とします
7) 可溶化画分300μLに対しαキモトリプシン溶液（14mg/mL in PBS）60μL添加。
8) 37℃1晩インキュベート
9) 限外濾過膜（例：Millipore社Microcon YM10）を通過させる（プロテアーゼ除去）
10) 限外濾過した濾液をHEL測定ELISAキットにて測定
※BHTは大変水に溶けにくいのでエタノール中に溶かしてからPBSに添加します。PBSや水に添加したときに濁りを生じる場合があります。 |
| 8 |
検量線の計算方法 |
Q：検量線の近似関数は何が適していますか？
A：片対数（吸光度＝真数、濃度＝対数）の曲線近似であれば基本的にどのアルゴリズムでも問題なく使用できます。
特に最近のマイクロプレートリーダーには検量線計算機能を備えている機種も多くありますのでご活用ください。また、片対数の折れ線（ジグザグ）でも
十分な近似関数ができます。
お困りの場合には検量線計算依頼フォームより、弊社までデータをお送りください。
マイクロプレートリーダーにつきましては450nmの吸光度を測定できる機種であれば、基本的にどの機種でも対応可能です。PCに接続されているタイプですと
検量線計算機能が使えるので便利です。例えば下記の機種はPC付きで比較的安価にて入手可能です。
機種例：「吸光マイクロプレートリーダー サンライズリモート」 和光純薬工業（株）Code. 523-79691
⇒詳細はこちらをご覧ください。
ELISA検量線の計算ソフトウェアにつきましては、例えば下記のような製品が利用可能です。
「LS-PLATE manager2004」和光純薬工業（株）code.293-44751（Windows版）
「LS-PLATE manager2000」和光純薬工業（株）code.292-34951（Macintosh版）
⇒詳細はこちらをご覧ください。
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| 9 |
ELISAキットの
分割使用について |
Q：ELISAキットは何回に分けて使えますか？
A：弊社のELISAキットは8ウェル*12本で構成されておりますので、サンプル数に合わせて分割してご利用いただけます。
測定ごとに毎回検量線を作成する必要がありますのでご注意ください。検量線には6レベル*3＝18ウェルが必要です。殆どのサンプルは-20℃以下で安定に
保存できますので、一度にまとめて測定した方がより多くのサンプルを測定できます。
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よろしければ質問・コメント・研究事例などお寄せください。 |
| 【参考文献】 |
| 1) |
Y. Kato, Y. Mori, Y. Makino, Y. Morimitsu, S. Hiroi, T. Ishikawa, T. Osawa.:
Formation of Nε-(hexanonyl) lysine in protein exposed to lipid hydroperoxide.
J. Biol. Chem. 274(29) p20406-20414 (1999) |
| 2) |
Y. Kato, T. Osawa:
Detection of lipid hydroperoxide-derived protein modification with polyclonal antibodies.
Methods in Molecular Biology, vol. 186, Oxidative stress biomarkers and antioxidant protocols, D Armstrong, Ed., Human Press Inc., NJ, USA, p37-44 |
| 3) |
児玉 充央ら:
「ヒト粥状硬化巣における酸化変性産物Ｎε-(hexanonyl) lysineおよびdityrosineの局在に関する免疫組織化学的検討」
日本動脈硬化学会（2002） |
| 4) |
Y. Kato, Y. Miyake, K. Yamamoto, Y. Shimomura, H. Ochi, Y. Mori, T. Osawa:
Preparation of a monoclonal antibody to Nε-(hexanonyl) lysine: applycation to the evaluation of protective effects of flavonoid supplementation against exercise-induced oxidative stress in rat skeletal muscle.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 274(2), p389-393 (2000) |
| 5) |
M. Naito, Wu X, H. Nomura, M. Kodama, Y. Kato, Y. Kato, T. Osawa:
The protective effects of tetrahydrocurcumin on oxidative stress in cholesterol-fed rabbits.
J Atheroscler Thromb. 9(5), p243-250 (2002) |
| 6) |
H. Arai, Y. Kato, K. Fukunaga, S. Mohri, and K. Nakamura:
Formation of Nepsilon-(hexanonyl)lysine in oxidized human very-low density lipoprotein.
J. Electrophoresis 48, p37-40 (2004) |
| 7) |
Y. Kato, A. Yoshida, M. Naito, Y. Kawai, K. Tsuji, M. Kitamura, N. Kitamoto, and T. Osawa:
Identification and Quantification of N-epsilon-(Hexanoyl)lysine in human urine by liquid chromatography/tandem mass spectrometry.
Free Radic. Bio.l Med. 37(11), p1864-1874 (2004) |
| 8) |
T. Osawa, Y. Kato:
Protective role of antioxidative food factors in oxidative stress caused by hyperglycemia.
Ann N Y Acad Sci. 1043, p440-451 (2005) |
| 9) |
K. Minato, M. Gono,H. Yamaguchi, Y. Kato, T. Osawa:
Accumulation of Nepsilon-(Hexanoyl)lysine, an oxidative stress biomarker, in rice seeds during storage.
Biosci Biotechnol Biochem. 69(9), p1806-1810 (2005)
コメ（ササニシキ）を40℃で保存するとHELが上昇することが報告されています。 |
| 10) |
Ryo K, Yamada H, Nakagawa Y, Tai Y, Obara K, Inoue H, Mishima K, Saito I:
Possible involvement of oxidative stress in salivary gland of patients with Sjogren's syndrome.
Pathobiology. 73(5):252-60.(2006)
唾液中のHELはシェーグレン症候群において高値を示すことが報告されています。 |
| 11) |
Suzuki T, Kazui T, Yamamoto S, Washiyama N, Ohkura K, Ohishi K, Bashar AH, Yamashita K, Terada H, Suzuki K, Akuzawa S, Fujie M:
Effect of prophylactically administered edaravone during antegrade cerebral perfusion in a canine model of old cerebral infarction.
J Thorac Cardiovasc Surg.133(3):710-6.(2007) |
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| 抗HELモノクローナル抗体 |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
適用可能な動物種 |
ヒト、ウサギ、ラットなど幅広い動物種に適用可能です。
マウス組織への適用の際には、組織サンプル由来のマウスIgGへの対策が必要です。
例えばVector社Vector M.O.M. Immunodetection kit (code.PK2200・フナコシより入手可能)が利用可能と思われます。
抗HEL抗体による免疫組織染色データをひろく集め、皆様のご研究に役立てたいと考えております。
⇒ぜひ実験例をbiotech@jaica.comまでご一報ください。どうぞよろしくお願い申し上げます。 |
| 2 |
免疫組織染色プロトコル |
⇒詳細はこちらをご参照ください。 |
| 3 |
Western Blottingへの適用 |
本抗体はウェスタンブロットへの適用可能です。HELは主にタンパク質への付加体として存在しておりますので、複数のバンドが検出されると考えられます。
【参考文献】H. Arai, Y. Kato, K. Fukunaga, S. Mohri, and K. Nakamura:
Formation of Nepsilon-(hexanonyl)lysine in oxidized human very-low density lipoprotein.
J. Electrophoresis 48, p37-40 (2004)
酸化処理したヒトVLDLでのHEL検出例です。 |
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よろしければ質問・コメント・研究事例などお寄せください。 |
| 【参考文献】 |
| 1) |
Y. Kato, Y. Mori, Y. Makino, Y. Morimitsu, S. Hiroi, T. Ishikawa, T. Osawa.:
Formation of Nε-(hexanonyl) lysine in protein exposed to lipid hydroperoxide.
J. Biol. Chem. 274(29) p20406-20414 (1999) |
| 2) |
児玉 充央ら:
「ヒト粥状硬化巣における酸化変性産物Ｎε-(hexanonyl) lysineおよびdityrosineの局在に関する免疫組織化学的検討」
日本動脈硬化学会（2002） |
| 3) |
Y. Kato, Y. Miyake, K. Yamamoto, Y. Shimomura, H. Ochi, Y. Mori, T. Osawa:
Preparation of a monoclonal antibody to Nε-(hexanonyl) lysine: applycation to the evaluation of protective effects of flavonoid supplementation against exercise-induced oxidative stress in rat skeletal muscle.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 274(2), p389-393 (2000) |
| 4) |
H. Arai, Y. Kato, K. Fukunaga, S. Mohri, and K. Nakamura:
Formation of Nepsilon-(hexanonyl)lysine in oxidized human very-low density lipoprotein.
J. Electrophoresis 48, p37-40 (2004) |
| 5) |
Tomaru M, Takano H, Inoue K, Yanagisawa R, Osakabe N, Yasuda A, Shimada A, Kato Y, Uematsu H:
Pulmonary exposure to diesel exhaust particles enhances fatty change of the liver in obese diabetic mice.
Int J Mol Med. 19(1):17-22 (2007) |
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| 抗ジブロモチロシン(DiBrY)モノクローナル抗体 |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
適用可能な動物種 |
ヒト、ウサギ、ラットなど幅広い動物種に適用可能です。
マウス組織への適用の際には、組織サンプル由来のマウスIgGへの対策が必要です。
例えばVector社Vector M.O.M. Immunodetection kit (code.PK2200・フナコシより入手可能)が利用可能と思われます。
抗HEL抗体による免疫組織染色データをひろく集め、皆様のご研究に役立てたいと考えております。
⇒ぜひ実験例をbiotech@jaica.comまでご一報ください。どうぞよろしくお願い申し上げます。 |
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よろしければ質問・コメント・研究事例などお寄せください。 |
| 【参考文献】 |
| 1) |
Wu W, Chen Y, d'Avignon A, Hazen SL.
3-Bromotyrosine and 3,5-dibromotyrosine are major products of protein oxidation by eosinophil peroxidase: potential markers for eosinophil-dependent tissue injury in vivo.
Biochemistry 38(12), p3538-3548(1999) |
| 2) |
Kato Y, Kawai Y, Morinaga H, Kondo H, Dozaki N, Kitamoto N, Osawa T.
Immunogenicity of a brominated protein and successive establishment of a monoclonal antibody to dihalogenated tyrosine.
Free Radic Biol Med. 38(1), p24-31(2005) 本抗体の特異性に関する文献です。 |
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| 抗ジチロシン(DT)モノクローナル抗体 |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
適用可能な動物種 |
ヒト、ウサギ、ラットなど幅広い動物種に適用可能です。
マウス組織への適用の際には、組織サンプル由来のマウスIgGへの対策が必要です。
例えばVector社Vector M.O.M. Immunodetection kit (code.PK2200・フナコシより入手可能)が利用可能と思われます。
抗HEL抗体による免疫組織染色データをひろく集め、皆様のご研究に役立てたいと考えております。
⇒ぜひ実験例をbiotech@jaica.comまでご一報ください。どうぞよろしくお願い申し上げます。 |
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よろしければ質問・コメント・研究事例などお寄せください。 |
| 【参考文献】 |
| 1) |
Kato Y, Wu X, Naito M, Nomura H, Kitamoto N, Osawa T.
Immunochemical detection of protein dityrosine in atherosclerotic lesion of apo-E-deficient mice using a novel monoclonal antibody.
Biochem Biophys Res Commun. 275(1), p11-15 (2000). |
| 2) |
Kato Y, Kitamoto N, Kawai Y, Osawa T.
The hydrogen peroxide/copper ion system, but not other metal-catalyzed oxidation systems, produces protein-bound dityrosine.
Free Radic Biol Med. 2001 Sep 1;31(5):624-32. |
| 3) |
Matsuzaki M, Hasegawa T, Takeda A, Kikuchi A, Furukawa K, Kato Y, Itoyama Y.
Histochemical features of stress-induced aggregates in alpha-synuclein overexpressing cells.
Brain Res. 1004(1-2),p83-90(2004) |
| 4) |
Atwood CS, Perry G, Zeng H, Kato Y, Jones WD, Ling KQ, Huang X, Moir RD, Wang D, Sayre LM, Smith MA, Chen SG, Bush AI.
Copper mediates dityrosine cross-linking of Alzheimer's amyloid-beta.
Biochemistry. 43(2), p560-568 (2004) |
| 5) |
Shamoto-Nagai M, Maruyama W, Kato Y, Isobe K, Tanaka M, Naoi M, Osawa T.
An inhibitor of mitochondrial complex I, rotenone, inactivates proteasome by oxidative modification and induces aggregation of oxidized proteins in SH-SY5Y cells.
J Neurosci Res. 74(4), p589-597 (2003) |
| 6) |
Son TG, Zou Y, Yu BP, Lee J, Chung HY.
Aging effect on myeloperoxidase in rat kidney and its modulation by calorie restriction.
Free Radic Res. 39(3), p283-289 (2005) |
| 7) |
Son TG, Zou Y, Jung KJ, Yu BP, Ishigami A, Maruyama N, Lee J.
SMP30 deficiency causes increased oxidative stress in brain.
Mech Ageing Dev. 127(5), p451-457 (2006) |
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| 抗酸化能測定試薬「PAO」 |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
ヒト血清への適用 |
Q：血清サンプルは保存できますか？
A：冷蔵保存した血清は使用できません。必ず新鮮血清／血漿をご用意ください。-20℃以下での凍結保存が可能です。血清サンプルの冷蔵保存はアスコルビン酸や尿酸などの抗酸化物質に影響を与える場合があります。
Q：血漿サンプルは測定できますか？
A：ヘパリン血漿または血清サンプルが測定可能です。EDTA血漿は測定できません。
ヒト血清の平均値：1069±145μmol/L reducing power |
| 2 |
尿サンプルの測定 |
尿サンプルを対象に抗酸化性を測定できます。 尿酸濃度が2mMを超える尿サンプルは予め蒸留水にて4倍希釈してください。 |
| 3 |
食品サンプルの測定 |
・赤ワイン：蒸留水にて8倍希釈して測定してください（測定例 45,479 μmol/L）。
・日本酒：蒸留水にて原液〜8倍希釈して測定してください（測定例 18〜211 μmol/L）。
・紅茶：蒸留水にて8倍希釈して測定してください。
・コーヒー：蒸留水にて28倍希釈して測定してください。
・緑茶：蒸留水にて8倍以上に希釈して測定してください（測定例 8,728 〜60,816μmol/L）。 |
| 4 |
抗酸化物質の検出 |
本試薬で検出可能な抗酸化物質には少なくとも下記のものが知られています。
アスコルビン酸・トロロックス・ビタミンE・グルタチオン・アルブミン・ビリルビン・尿酸 |
| 5 |
検量線と標準物質 |
Q：検量線がうまく引けない場合はどうすれば良いですか？
A：本試薬の標準物質には尿酸を使用しております。尿酸は水に溶けにくいので、確実に尿酸を溶解してからご使用ください。また、使用する蒸留水の液量はボトル毎に異なっておりますので、ラベルに記載されている液量表示をご確認ください。
Q：溶解した標準物質は保存できますか？
A：蒸留水で溶解した標準物質（2mM尿酸）は冷蔵で１週間、-20℃以下の凍結保存で１年間保存できます。凍結融解の繰り返しは避けてください。
Q：尿酸濃度に2189を掛けるのは何故ですか？
A：尿酸の濃度から銅イオン還元量に換算するためです。 |
| 6 |
血漿サンプル以外への適用例 |
卵巣子宮内膜症性嚢胞、漿液性嚢胞腺腫、粘液性嚢胞腺腫の内容液におけるPAO測定値は1197 mmol/L、 672 mmol/L、424 mmol/Lであることが報告されています。
【出典】：S Fujii, 鉄を含む卵巣子宮内膜症性嚢胞の内容液がもたらす酸化ストレスの影響.
第31回 日本鉄バイオサイエンス学会 シンポジウム抄録. p9-10 (2007) |
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よろしければ質問・コメント・研究事例などお寄せください。 |
| 【参考文献】 |
| 1) |
Oxidative stress and its association with coronary artery disease and different atherogenic risk factors.
C VASSALLE, L PETROZZI , N BOTTO, MG ANDREASSI and GC ZUCCHELLI.
Journal of Internal Medicine, Vol.256, p308-315 (2004)
CAD患者では健常者対照に比べ血清抗酸化能（PAO）が低値を示す。さらにmulti-vessel disease群ではone-vessel disease群に比べ抗酸化能が有意に低い。 |
| 2) |
Vitamin E-coated dialyzers reduce oxidative stress related proteins and markers in hemodialysis ? a molecular biological approach.
LA Calo, A Naso, E Pagnin, PA Davis, M Castoro, R Corradin, P Riegler, C Cascone, W Huber and A Piccoli
Clinical Nephrology, Vol.62(5), p355-361 (2004) |
| 3) |
Oxidative stress-related factors in Bartter's and Gitelman9s syndrome: relevance for angiotensin IIsignalling.
Calo LA, Pagnin E, Davis PA, Sartori M, Semplicini A.
Nephrol Dial Transplant ,Vol.18(8) p1518-25 (2003) |
| 4) |
Effect of epoetin on HO-1 mRNA level and plasma antioxidants in hemodialysis patients.
Calo LA, Stanic L, Davis PA, Pagnin E, Munaretto G, Fusaro M, Landini S, Semplicini A, Piccoli A.
Int. J Clin. Ther, Vol.41(5), p187-92 (2003) |
| 5) |
Restored Antioxidant Capacity Parallels the Immunologic and Virologic Improvement in Children with Perinatal Human Immunodeficiency Virus Infection Receiving Highly Active Antiretroviral Therapy.
M Martino, F Chiarelli, M Moriondo, M Torello, C Azzari, and L Galli
Clinical Immunology, Vol.100(1),p82-6 (2001) |
| 6) |
Oxidative imbalance and cathepsin D changes as peripheral blood biomarkers of Alzheimer disease: A pilot study
E Strafacea, P Matarresea, L Gambardella, R Vona, A Sgadari,MC Silveri, W Malorni
FEBS Letters 579, p2759-766(2005)
アルツハイマー患者では健常者対照に比べ血清抗酸化能（PAO）が低値を示します。 |
| 7) |
Antioxidant capacity as a reliable marker of stress in dairy calves transported by road
P Pregel, E Bollo, FT Cannizzo, B Biolatti, E Contato, and PG Biolatti
Veterinary Record 156, p53-54 (2005)
ウシへの適応例。ストレスによって血清抗酸化能（PAO）が低下します。 |
| 8) |
Effetcts of the daily administration of a rehydrating supplement to trotter horses
A Falaschini, G Marangoni, S Rizzi and MF Trombetta
J Equine Sci 16(1),p1-9 (2005)
競走馬への適用例。 |
|
|
| イソプラスタン測定用ELISAキット |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
尿サンプルの希釈率 |
正常ヒト尿サンプルはキット付属の希釈液にて4倍または8倍希釈して測定してください。実験動物や患者尿の場合には4〜100倍希釈の範囲でご検討されることをお奨めします。
また、蛋白尿が疑われるケースでは限外濾過または固相抽出により夾雑物を除去されることをお奨めします。 |
| 2 |
血清・組織サンプルへの応用 |
血清または組織中のイソプラスタンを測定するためには、前処理として固相抽出が必要です。詳細につきましては別途お問い合わせください。 |
|
|
よろしければ質問・コメント・研究事例などお寄せください。 |
| 【参考文献】 |
| 1) |
Increased urinary 15-F2t-isoprostane concentrations in patients with non-ischaemic congestive heart failure: a marker of oxidative stress.
Heart 89, p871-874 (2003)
M Nonaka-Sarukawa, K Yamamoto, H Aoki, H Takano, T Katsuki, U Ikeda, K Shimada
うっ血性心不全患者の尿中15イソプラスタンF2ｔは対照群（125〜281 pg/mg CRE、平均198）に比べ、有意に高値（148〜425 pg/mgCRE、平均280。NYHAクラスIまたはII）。NYHAクラスIIIまたはIVの群では（355〜720 pg/mgCRE、平均600）を示す。 |
| 2) |
8-Isoprostane-induced endothelin-1 production by infant rat pulmonary artery smooth muscle cells is mediated by Rho-kinase.
Free Radical Biology and Medicine, 41(6), Pages 942-949(2006)
Soojin L. Yi, Crystal Kantores, Rosetta Belcastro, Judy Cabacungan, A. Keith Tanswell and Robert P. Jankova.
8-イソプラスタンはラット肺動脈由来平滑筋細胞(PASMCs)においてET(endothelin)-1産生を刺激します。このときの シグナル経路にはトロンボキサンA2受容体 ⇒Rhoキナーゼの関与が示唆されています。 |
|
|
| アクロレイン(ACR)測定用ELISAキット |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
サンプルの前処理 |
尿サンプルを測定する場合には、付属の希釈液で10倍以上に希釈してから測定してください。また、サンプルに濁りがある場合や 血球等の不溶物がある場合には、測定前に遠心分離（例：3000rpm * 10分）して濁り、不溶物を除去してから希釈、測定してください。 |
| 2 |
開封後の有効期限 |
1次反応試薬、酵素標識抗体試薬は、調製後は冷蔵にて24時間保存できます。開封後は24時間以内にご使用ください。
また、発色試薬は使用直前に必要量のみ調製してください。 |
| 3 |
油の酸化度測定 |
油脂サンプルに含まれるアクロレインを測定することが可能です。
1) 油脂サンプルに対し、BSA 1mg/mL PBSを添加します。
2) ホモジネート（例：ボルテックス２時間）
3) 油層/水層を分離させ、水層を回収します。
4) 水層画分をACR ELISAキットにて測定します。
（油の酸化度とほぼ相関する形で、ACRが検出されます） |
| 4 |
組織サンプルへの適用 |
組織サンプル中のACR測定法は確立されておりませんが、下記の方法で測定できる可能性があります。
1) 組織サンプルを0.1% BHT/PBS中にホモジナイズします。
2) 遠心上清を回収し、ELISAに適用します。 |
| 5 |
血清サンプルへの適用 |
ACR ELISAキットの血清サンプルでの測定は確立されていないようです。検討される場合には再現性などにご留意ください。 |
|
|
よろしければ質問・コメント・研究事例などお寄せください。 |
| 【参考文献】 |
| 1) |
Koji Utida et al.,
Acrolein is a product of lipid peroxidation：formation of freeacrolein and its conjugate with lysine residues in oxidative low density lipoproteins.
J.Biol.Chem.,273,p16058(1998) |
| 2) |
Koji Utida et al.
Protein-bound acrolein ：Potential markers for oxidative stress.
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95, p4882(1998) |
| 3) |
Noel Y.Calingasar et al.
Protein-bound acrolein ：A novel marker of oxidative stress in Alzheimer's disease.
J.Neurochemistry 72, p751(1999) |
| 4) |
K.Satoh, et al.
A 1-hour enzyme-linked immunosorbent assay for quantitation of acrolein ＆ hydroxynonenal-modified proteins by epitope-bound casein matrix method.
Analytical Biochemistry 270, p323-328 (1999) |
| 5) |
Tsukahara H et al.
Oxidant and antioxidant activities in childhood meningitis.
Life Sci. 71(23),p2797-806 (2002) |
| 6) |
Noiri E et al.
Serum protein acrolein adducts: utility in detecting oxidant stress in hemodialysis patients and reversal using a vitamin E-bonded hemodialyzer.
Free Radic Biol Med. 33(12),p1651-6 (2002) |
| 7) |
Sukahara H
Formation of advanced glycosylation end products and oxidative stress in young patients with type 1 diabetes.
Pediatr Res. 54(3), p419-24(2003) |
| 8) |
Daimon M et al.
Increased urinary levels of pentosidine, pyrraline and acrolein adduct in type 2 diabetes.
Endocr J. 50(1),p61-7 (2003) |
| 9) |
Sakata K et al.
Increase in putrescine, amine oxidase, and acrolein in plasma of renal failure patients.
Biochem Biophys Res Commun. 305(1), p143-9 (2003) |
| 10) |
Tsukahara H et al.
Oxidative stress in neonates: evaluation using specific biomarkers.
Life Sci. 75(8), p933-8 (2004) |
| 11) |
Tomitori M. et al.
Polyamine oxidase and acrolein as novel biochemical markers for diagnosis of cerebral stroke.
Stroke, 36, p2609 (2005). |
| 12) |
Shimizu K et al.
Examination of urine acrolein in Yusho victims.
Fukuoka Igaku Zasshi. 96(5), p214-5 (2005) |
| 13) |
Hata I et al.
Urinary oxidative stress markers in young patients with type 1 diabetes.
Pediatr Int. 48(1), p58-61 (2006) |
| 14) |
Igarashi K et al.
Physiological functions of polyamines and regulation of polyamine content in cells.
Yakugaku Zasshi. 126(7), p455-71 (2006) |
| 15) |
Igarashi K et al.
Polyamines in renal failure.
Amino Acids. 31(4), p477-83 (2006) |
| 16) |
Nakagawa N et al.
An oral adsorbent, AST-120, suppresses oxidative stress in uremic rats.
Am J Nephrol. 26(5), p455-61 (2006) |
| 17) |
Tamura S et al.
Evaluation of a urinary multi-parameter biomarker set for oxidative stress in children, adolescents and young adults.
Free Radic Res. 40(11), p1198-205 (2006) |
| 18) |
Taki K et al.
Indoxyl sulfate-lowering capacity of oral sorbents affects the prognosis of kidney function and oxidative stress in chronic kidney disease.
J Ren Nutr. 17(1), p48-52 (2007) |
|
|
| 抗アクロレイン(ACR)抗体 |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
免疫組織染色への適用 |
1) ホルマリン固定パラフィン包埋切片（4〜6μｍ厚）を脱パラフィン処理します。
2) 3% H2O2に10〜20分間浸し、内因性ペルオキシダーゼを不活化させます。
3）正常血清または3% BSA / PBSにて室温30分間ブロッキング処理をします。
4）抗ACR抗体（推奨濃度0.5〜1.0μg/mL）にて4℃一晩反応させます。
5）PBSにて洗浄します。
6）ABC法(アビジン-ビオチンcomplex法)で染色します。発色基質にはDABを用います。
7）ヘマトキシリンまたはメチルグリーンにて対比染色をします。
※1次抗体の希釈液：1% BSA, 0.1% NaN3, PBS pH7.6
※蛋白質分解酵素処理は、染色性を減弱させることがあります。 |
| 2 |
アクロレインの入手先 |
アクロレイン（アルデヒド）はSigma-Aldrich社より入手可能です。
Aldrich, code#110221 (Acrolein) |
|
|
よろしければ質問・コメント・研究事例などお寄せください。 |
| 【参考文献】 |
| 1) |
Protein-bound acrolein: Potential markers for oxidativestress.
K.Uchida, M.Kanematsu, K.Sakai, T.Matsuda, N.Hattori,Y.Mizuno, D.Suzuki,T.Miyata, N.Noguchi, E.Niki,T.Osawa
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,4882-4887(1998) |
| 2) |
Protein-bound acrolein: A novel markers of oxidativestress in Alzheimer's Disease.
Noel Y. Calingasan, Koji Uchida, and Gary E.Gibson
Journal of Neurochemistry.72(2),751-756(1999) |
| 3) |
A 1-Hour Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Quantitation of Acrolein- and Hydroxynonenal- Modified Proteins by Epitope-Bound CaseinMatrix Method.
K.Satoh,S.Yamada,Y.Koike,Y.Igarashi,S.Toyokuni,T.Kumano,T.Takahata,S.Tsuchida and K.Uchida
Analytical Biochemistry.270,323-328(1999) |
| 4) |
Red blood cells inhibit activation-induced cell death and oxidative stress in human peripheral blood T lymphocytes.
Fonseca AM, Porto G, Uchida K, Arosa FA.
Blood. 97(10), p3152-60 (2001) |
| 5) |
Thiolation of protein-bound carcinogenic aldehyde. An electrophilic acrolein-lysine adduct that covalently binds to thiols.
Furuhata A, Nakamura M, Osawa T, Uchida K.
J Biol Chem. 277(31), p27919-27926 (2002) |
| 6) |
Tissue distribution of lipid peroxidation product acrolein in human colon carcinogenesis.
Kamelija Zarkovic, Koji Uchida, Danijela Kolenc, Ljiljana Hlupic, Neven Zarkovic
Free Radical Research, 40(6), p543 - 552 (2006)
結腸ガン組織におけるアクロレインの免疫組織染色 |
|
|
| 抗マロンジアルデヒド(MDA)抗体 |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
免疫組織染色プロトコル |
1）ホルマリン固定パラフィン包埋切片（4〜6μｍ厚）を脱パラフィン処理します。
2）3% H2O2にて10〜20分処理し、内因性ペルオキシダーゼを不活化します。
3）PBS（pH7.6）にて5分間 X 3回洗浄します。
4）正常血清または3% BSA / PBSにて室温30分間ブロッキング処理します。
5）抗MDA抗体を希釈液（1% BSA, 0.1% NaN3, PBS pH7.6）にて100〜200倍に希釈し、4℃一晩反応させます。
6）ABC法（アビジン-ビオチンcomplex法）にて染色します。発色基質にはDABを用います。
7）ヘマトキシリンまたはメチルグリーンにて対比染色をします。
※48時間以上固定処理したサンプルでは、染色性が低下する場合があります。
蛋白質分解酵素処理は染色性を低下させる場合があります。 |
|
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よろしければ質問・コメント・研究事例などお寄せください。 |
| 【参考文献】 |
| 1) |
Immunochemical detection of a lipofuscin-like fluorophore derivered from malondialdehyde and lysine.
S Yamada, S Kumazawa, T Ishii, T Nakayama, K Itakura, N Shibata, M Kobayashi, K Sakai, T Osawa and K Uchida.
J.Lipid Res. 42, p1187-1196 (2001) |
|
| 抗メチルグリオキザール(MG)抗体 |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
免疫組織染色プロトコル |
1）ホルマリン固定パラフィン包埋切片（4〜6μｍ厚）を脱パラフィン処理します。
2）3% H2O2にて10〜20分処理し、内因性ペルオキシダーゼを不活化します。
3）PBS（pH7.6）にて5分間 X 3回洗浄します。
4）正常血清または3% BSA / PBSにて室温30分間ブロッキング処理します。
5）抗MG抗体を希釈液（1% BSA, 0.1% NaN3, PBS pH7.6）にて100〜200倍に希釈し、4℃一晩反応させます。
6）ABC法（アビジン-ビオチンcomplex法）にて染色します。発色基質にはDABを用います。
7）ヘマトキシリンまたはメチルグリーンにて対比染色をします。
※48時間以上固定処理したサンプルでは、染色性が低下する場合があります。
蛋白質分解酵素処理は染色性を低下させる場合があります。 |
| 2 |
ウェスタンブロットへの適用 |
本抗体はウェスタンブロットにも適用可能です。
参考文献：Argpyrimidine, a blue fluorophore in human lens proteins: high levels in brunescent cataractous lenses.
Padayatti PS, Ng AS, Uchida K, Glomb MA, Nagaraj RH
Invest Ophthalmol Vis Sci. 42(6), p1299-1304. (2001)ヒト レンズ蛋白質の研究例 |
|
|
よろしければ質問・コメント・研究事例などお寄せください。 |
| 【参考文献】 |
| 1) |
Protein modification by a Maillard reaction intermediate methylglyoxal. Immunochemical detection of fluorescent 5-methylimidazolone derivatives in vivo.
Uchida K, Khor OT, Oya T, Osawa T, Yasuda Y, Miyata T
FEBS Lett. 410(2-3), p313-318. (1997) |
| 2) |
Immunological evidence for methylglyoxal-derived modifications in vivo.
Farrukh A Shamsi, Andreea Partal, Candase Sady, Marcus A Glomb and Ramanakoppa H Nagaraj
J. Biol. Chem., 273(12), p6928-6936 (1998)
MethylglyoxalをELISAにて検出した研究例です。 |
| 3) |
Methylglyoxal Modification of Protein -Chemical and Immunochemical Characterization of Methylglyoxal-Arginine Adduct.
T.Oya, N.Hattori, Y.Mizuno, S.Miyata, S.Maeda, T.Osawa and K.Uchida
J. Biol. Chem., 274, 18492-18502 (1999) |
| 4) |
Advanced glycation and lipidoxidation of the peritoneal membrane: respective roles of serum and peritoneal fluid reactive carbonyl compounds.
Miyata T, Horie K, Ueda Y, Fujita Y, Izuhara Y, Hirano H, Uchida K, Saito A, van Ypersele de Strihou C, Kurokawa K
Kidney Int. 58(1), p425-435.(2000) |
| 5) |
Argpyrimidine, a blue fluorophore in human lens proteins: high levels in brunescent cataractous lenses.
Padayatti PS, Ng AS, Uchida K, Glomb MA, Nagaraj RH
Invest Ophthalmol Vis Sci. 42(6), p1299-1304. (2001) |
| 6) |
High concentrations of glucose induce synthesis of argpyrimidine in retinal endothelial cells.
Padayatti PS, Jiang C, Glomb MA, Uchida K, Nagaraj RH
Curr Eye Res. 23(2), p106-115. (2001) |
| 7) |
Curcumin Inhibits ROS Formation and Apoptosis in Methylglyoxal-Treated Human Hepatoma G2 Cells.
WEN-HSIUNG CHAN, HSIN-JUNG WU and YAN-DER HSUUW
Ann. N.Y. Acad. Sci. 1042: 372-378 (2005) |
| 8) |
Heat-shock protein 27 is a major methylglyoxal-modified protein in endotherial cells.
Casper G Schalkwijk, Jan van Bezu, Roel C van der Schors, Koji Uchida, Coen DA Stehouwer, Victor WM van Hinsbergh.
FEBS Lett. 580, p1565-1570 (2006)
Erratum to: "Heat-shock protein 27 is a major methylglyoxal-modified protein in endotherial cells."
FEBS Lett. 580, p2400 (2006)
血管内皮細胞においてHSP27がメチルグリオキザール修飾されることが報告されています。 |
| 9) |
Methyl glyoxal elevation is associated with oxidative stress in rheumatoid arthritis.
S. Mukhopadhyay, S. Sen, B. Majhi, K. P. Das, M. Kar
Free Radical Research 41(5) p507-514(2007)
関節リウマチ患者148名および正常対照群88名を対象とした研究。関節リウマチ患者においてメチルグリオキザール（MG）はTBARS値上昇およびGSH減少に関連して上昇することが報告されています。 |
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|
| 抗クロトンアルデヒド(CRA)抗体 |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
免疫組織染色プロトコル |
1）ホルマリン固定パラフィン包埋切片（4〜6μｍ厚）を脱パラフィン処理します。
2）3% H2O2にて10〜20分処理し、内因性ペルオキシダーゼを不活化します。
3）PBS（pH7.6）にて5分間 X 3回洗浄します。
4）正常血清または3% BSA / PBSにて室温30分間ブロッキング処理します。
5）抗CRA抗体を希釈液（1% BSA, 0.1% NaN3, PBS pH7.6）にて100〜200倍に希釈し、4℃一晩反応させます。
6）ABC法（アビジン-ビオチンcomplex法）にて染色します。発色基質にはDABを用います。
7）ヘマトキシリンまたはメチルグリーンにて対比染色をします。
※48時間以上固定処理したサンプルでは、染色性が低下する場合があります。
蛋白質分解酵素処理は染色性を低下させる場合があります。 |
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よろしければ質問・コメント・研究事例などお寄せください。 |
| 抗4-ヒドロキシ-2-ヘキセナール(4-HHE)抗体 |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
免疫組織染色プロトコル |
1）ホルマリン固定パラフィン包埋切片（4〜6μｍ厚）を脱パラフィン処理します。
2）3% H2O2にて10〜20分処理し、内因性ペルオキシダーゼを不活化します。
3）PBS（pH7.6）にて5分間 X 3回洗浄します。
4）正常血清または3% BSA / PBSにて室温30分間ブロッキング処理します。
5）抗4-HHE抗体を希釈液（1% BSA, 0.1% NaN3, PBS pH7.6）にて100〜200倍に希釈し、4℃一晩反応させます。
6）ABC法（アビジン-ビオチンcomplex法）にて染色します。発色基質にはDABを用います。
7）ヘマトキシリンまたはメチルグリーンにて対比染色をします。
※48時間以上固定処理したサンプルでは、染色性が低下する場合があります。
蛋白質分解酵素処理は染色性を低下させる場合があります。 |
|
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よろしければ質問・コメント・研究事例などお寄せください。 |
| 【参考文献】 |
| 1) |
Protein-bound 4-hydroxy-2-hexenal as a marker of oxidized n-3 polyunsaturated fatty acids.
Yamada S, Funada T, Shibata N, Kobayashi M, Kawai Y, Tatsuda E, Furuhata A, Uchida K.
J Lipid Res. 45(4), p626-634 (2004) |
| 2) |
Accumulation of protein-bound 4-hydroxy-2-hexenal in spinal cords from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis.
Shibata N, Yamada S, Uchida K, Hirano A, Sakoda S, Fujimura H, Sasaki S, Iwata M, Toi S, Kawaguchi M, Yamamoto T, Kobayashi M
Brain Res. 1019(1-2), p170-177 (2004) |
|
|
| 抗7-ケトコレステロール(7-KC)抗体 |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
適用可能な組織サンプル |
7-KCの免疫組織染色サンプルには、凍結切片をご用意ください。パラフィン包埋サンプルは適用できません。 これは7-KCは溶剤に溶解してしまうためです。凍結切片の作製は下記のように行います。
1) 組織サンプルを20％ホルマリンで固定します。
2) 30%ショ糖に浸し、組織中の固定液をショ糖液に完全に置換します。
3) ドライアイスアセトン上でOCTコンパウンドに凍結包埋し、クリオスタットを用いて凍結切片を作製します。 |
| 2 |
免疫組織染色プロトコル |
1）OCTコンパウンド包埋 凍結組織から包埋切片（3〜7μｍ厚）を作製します。
2）凍結切片をPBS（pH7.6）で洗浄し、OCTコンパウンドを除去します。
3）1% EDTAを含む3% H2O2/PBSにて15分間、内因性ペルオキシダーゼの不活化処理をします。
4）PBS（pH7.6）にて洗浄します。
5）正常血清(3%)にて室温30分間、ブロッキング処理をします。
6）PBS（pH7.6）にて洗浄します。
7）内因性アビジンビオチン活性を不活化させます。
8）PBS（pH7.6）にて洗浄します。
9）抗7-KC抗体を希釈液（1% BSA, 0.1% NaN3, 1.5mM EDTA, 10mM PBS pH7.6）にて希釈し、4℃一晩反応させます。
10) ABC法（アビジン-ビオチンcomplex法）にて染色します。発色基質にはDABを用います。
11）ヘマトキシリンまたはメチルグリーンにて対比染色をします。 |
| 3 |
サンプル固定条件 |
5mm厚以内に切り出した新鮮組織の固定には、20％ホルマリン中にて24〜48時間以内の固定が望ましい。 |
| 4 |
過酸化水素処理の際のEDTAについて |
MilliQ水であれば通常EDTAを添加する必要はありませんが、EDTAの有無により染色性に影響が出る場合には 過酸化水素処理の際に1% EDTAを添加することをお奨めします。 |
| 5 |
内因性アビジンビオチンのブロッキング |
Vector社よりブロッキングキットが市販されておりますので、ご利用ください。 |
| 6 |
2次抗体について |
使用するキットによって異なります。例えばウサギ 抗マウスIgGやヤギ 抗マウスIgGを5000〜10000倍希釈して 室温にて2時間程度反応させます。詳しくはご利用になるABCキットの説明書をご参照ください。 |
| 7 |
サンプル切片の厚さ |
なるべく3〜7μｍ厚に調製することをお奨めします。特に20μｍ厚を超えると、浸透性が悪くなる可能性が考えられます。 |
|
|
よろしければ質問・コメント・研究事例などお寄せください。 |
| 【参考文献】 |
| 1) |
Oxysterol mixtures, in atheroma-relevant proportions, display synergistic and proapoptotic effects.
Free Radical Biology and Medicine, 41(6), p902-910 (2006)
David A. Larsson, Sarah Baird, Jerome Diinga Nyhalah, Xi-Ming Yuan and Wei Li
7-KCの細胞毒性に関する文献です。7-KCは酸化LDLやアテローム性動脈硬化病変部位に存在し、細胞毒性を示します。 |
| 2) |
In vivo interconversion of 7β-hydroxycholesterol and 7-ketocholesterol, potential surrogate markers for oxidative stress.
Free Radical Biology and Medicine 43(5), p695-701(2007)
Hanna Larsson, Ylva Bottiger, Luigi Iuliano and Ulf Diczfalusy
7β-hydroxycholesterol と 7-ketocholesterolはヒト生体内において相互変換することが示されています。重水素標識した7-ketocholesterolを健常者ボランティア2名に静注。7-ketocholesterolの血中半減期は1.5時間。 |
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