酸化ストレスマーカー：血清イソプラスタン測定キット

Rev.131017

血清イソプラスタン測定キット
(Serum / tissue isoprostane F_2t ELISA)

（酸化ストレス研究用試薬）

【リン脂質の酸化損傷マーカー】

イソプラスタン（15-Isoprostane F_2t）は細胞膜やリポ蛋白に含まれるリン脂質がフリーラジカルにより酸化されて形成されるプロスタグランジン様の化合物で、喫煙、糖尿病、動脈硬化との関連性が報告されております。本キットは15-イソプラスタンF_2t（15-isoprostane F_2t：8-isoprostanes）を測定するELISAキットです。サンプルを予め固相抽出処理することにより、血清、血漿、組織、尿など多様なサンプルに適用することができます。

また、イソプラスタンは、血液中では遊離型と、リン脂質にエステル結合した形の２種類があることが知られています。前処理として加水分解を実施することで、トータルのイソプラスタン（遊離型+結合型）を測定可能です。

【測定原理】

1.マイクロプレートに抗15-isoprostane F_2t抗体を固相化します。

2.サンプルおよびHRP標識-15-isoprostane F_2tを分注します。

3.発色基質TMBによりウェルに結合したHRP標識-15-isoprostane F_2tを検出し、サンプル中の 15-isoprostane F_2t濃度を算出します。

【製品仕様】

● 測定対象：	イソプラスタンF_2t
● 測定レンジ：	0.05～10 ng/mL（検出下限は0.01 ng/mL）
● 所要時間：	約3時間（サンプル前処理に要する時間を除く）
● サンプル所要量：	10 mL（血清中の遊離イソプラスタン測定時） 1 mL（加水分解処理により血漿トータルイソプラスタン測定時）
● テスト数：	96ウェル（N=2のとき40サンプル測定可能）。
● 必要な器具等：	マイクロプレートリーダー（測定波長450nm）、8チャンネルマイクロピペット（50～250μL）、マイクロピペット（5～1000μL用）、プラスチック試験管、3M 硫酸、固相抽出および加水分解処理に必要な資材
● 保存条件：	冷蔵（2～10℃ ・凍結不可）

【キットの構成】

1）Microwells 抗体固相化済み：	96 wells	そのまま使用します。
2）15-isoprostane F_2t Standard：	1本（約60μL * 2本）	希釈液（Working dilution buffer）にて希釈して使用します。
3）Wash buffer（ｘ5）	1本（40mL）	蒸留水160mLと混合して使用します（Working wash buffer）。
4）Dilution buffer（ｘ5）：	1本（100mL）	蒸留水400mLと混合して使用します（Working dilution buffer）。
5）TMB substrate：	1本（25mL）	そのまま使用します。
6）Isoprostane F_2t-HRP conjugate：	1本（約100μL）	90μLをとり、11.91 mLの希釈液（Working dilution buffer）と混合します。
7）試薬トレー：	2個（8チャネルピペット用）	そのまま使用します。

【測定手順】

固相抽出したサンプルを、希釈液（Working dilution buffer）にて希釈して測定します。希釈率はサンプル中のイソプラスタン量に応じて異なります。反応停止液（3M 硫酸）は別途ご用意ください。
Step 1）	希釈済みのサンプルまたはスタンダード（S₀～S₇）を Microwellsに100μL/well分注します。
Step 2）	希釈済みのHRPコンジュゲートをブランクウェルを除く全てのウェルに100μL分注します。ブランクウェルには希釈液（Working dilution buffer）を100μL分注します（計200μL）。軽く振とう攪拌して、室温にて2時間静置します。
Step 3）	プレートを裏表逆にして液を捨てます。清潔なペーパータオルに叩きつけて液を切ります。
Step 4）	全てのウェルに洗浄液 400μLを分注し、2分間静置、Step3と同様に液を捨て清潔なペーパータオルに叩きつけて液を切ります。この洗浄操作を3回繰り返します。
Step 5）	発色基質（TMB substrate）を全てのウェルに200μL分注し、20～30分間静置します。
Step 6）	全てのウェルに3M 硫酸を50μL分注し、反応を停止させます。
Step 7）	450nmにおける吸光度を測定します。
Step 8）	スタンダードS₀における吸光度をB₀とし、スタンダードS₁ ～S₇の吸光度との比（B／B₀）を、片対数方眼紙にプロットし、検量線を作成します。
Step 9）	サンプルの吸光度（B）とB₀の比（B／B₀）より、サンプル中のイソプラスタン濃度を算出します。必要に応じて、固相抽出の回収率等による補正を行います。

【参考文献】

1)	Morrow JD, Hill KE, Burk RF, Nammour TM, Badr KF, Roberts LJ 2nd: A series of prostaglandin F2-like compounds are produced in vivo in humans by a non-cyclooxygenase, free radical-catalyzed mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 87(23),p9383-9387 (1990)
2)	Morrow JD, Awad JA, Boss HJ, Blair IA, Roberts LJ 2nd: Non-cyclooxygenase-derived prostanoids (F2-isoprostanes) are formed in situ on phospholipids. Proc Natl Acad Sci U S A. 89(22), p10721-10725 (1992).
3)	Morrow JD, Zackert WE, Yang JP, Kurhts EH, Callewaert D, Dworski R, Kanai K, Taber D, Moore K, Oates JA, Roberts LJ: Quantification of the major urinary metabolite of 15-F2t-isoprostane (8-iso-PGF2alpha) by a stable isotope dilution mass spectrometric assay. Anal Biochem. 269(2), p326-331 (1999)

品名	商品コード	測定レンジ	所要時間	価格（税込）
血清イソプラスタン測定ELISAキット	KIP-001W	0.05～10 ng/mL	約3時間	132,000円

【製造元】：Northwest Life Science Specialities LLC, USA

【スタンダードの調製方法】

スタンダード原液（15-isoprostane F_2t Standard:1μg/mL）より、下記の手順に従い S₇～S₀の計 8レベルのスタンダードを調製します。
S₇（100 ng/mL）：	原液 50μLに対し、希釈液（Working dilution buffer）450μLを混合します。
S₆（50 ng/mL）：	上記で調製したS₇ 200μLに対し、希釈液 200μLを混合します。
S₅（10 ng/mL）：	上記で調製したS₆ 100μLに対し、希釈液 400μLを混合します。
S₄（5 ng/mL）：	上記で調製したS₅ 200μLに対し、希釈液 200μLを混合します。
S₃（1 ng/mL）：	上記で調製したS₄ 100μLに対し、希釈液 400μLを混合します。
S₂（0.1 ng/mL）：	上記で調製したS₃ 100μLに対し、希釈液 900μLを混合します。
S₁（0.05 ng/mL）：	上記で調製したS₂ 500μLに対し、希釈液 500μLを混合します。
S₀（0 ng/mL＝B₀）：	希釈液（Working dilution buffer）をそのまま用います。

【サンプルの前処理（固相抽出）】

本キットで血清、血漿、尿、培養上清その他のサンプルを測定する場合には、予め固相抽出処理が必要です。回収率を確認するために、サンプルに既知濃度のイソプラスタン（STD:5ng）を加えたものを調製し、回収率を測定し、補正を行うことを推奨します。 [回収率％] ＝（ [STD添加したサンプルの測定値] － [STD未添加サンプルの測定値] ）÷ [添加したSTD]
必要な試薬類 C18 Sep-Pak、Silica Sep-Pak、pH3 water（精製水に塩酸を加え、pH3とします）、塩酸（1N）、エタノールヘプタン、酢酸エチル、硫酸ナトリウム、メタノール、窒素ガス
Step 1）	血清/血漿サンプル10mLに対し、3ｍLのpH3 waterを混合します。
Step 2）	1N 塩酸を加え、pHを3に調製します。
Step 3）	C18 Sep-Pakによる抽出 C18 Sep-Pakにエタノール5mLを流し、続いてpH3 water 5mLを流しておきます。サンプルを添加します。 pH3 water 10ｍL、続いてヘプタン 10mLを流して洗浄します。 10mLの酢酸エチル/ヘプタン混合液（1：1）を流して溶出し、溶出液を回収します。溶出液に硫酸ナトリウムを添加します（一匙分）。
Step 4）	Silica Sep-Pakによる抽出 Silica Sep-Pakにメタノール5mLを流し、続いて酢酸エチル 5mLを流しておきます。 C18 Sep-Pakからの溶出液を添加します。硫酸ナトリウムの粒がカラムに入らないよう注意します。酢酸エチル 5mLを流して洗浄します。 5mLの酢酸エチル/メタノール混合液（1：1）を流して溶出し、溶出液を回収します。
Step 5）	溶出液を、窒素ガスの存在下で乾固させます。
Step 6）	希釈液（Working dilution buffer）にて溶解し、ELISAに適用します。このとき溶解に使用した希釈液の液量を記録してください。

【サンプルの前処理（加水分解処理）】

血液中のイソプラスタンは、遊離型のほか、リン脂質にエステル結合した形でも存在することが知られています。加水分解処理をしたのち、固相抽出処理をすることにより、トータルのイソプラスタン濃度（遊離型 + 結合型）を測定することができます。
血漿サンプルの加水分解処理
Step 1）	Folch試薬を調製します。クロロホルムとメタノールを2：1混合し、 BHTを 5mg/100mL、トリフェニルホスフィンを 50mg/100mL溶解します。
Step 2）	50mLのチューブにFolch試薬 20mLを入れ、氷冷しておきます。
Step 3）	血漿 1mLを添加し、1分間ボルテックスにて攪拌混合します。
Step 4）	氷冷した0.043％ MgCl₂水溶液 10mLを添加し、1分間ボルテックスにて攪拌混合します。
Step 5）	2～3分遠心します。
Step 6）	有機溶剤の層を回収します。このとき蛋白質を含む層が入らないようにご注意ください。
Step 7）	回収した有機溶剤の層を窒素ガス存在下で乾固させます。
Step 8）	BHT 5mg/100mLを含むメタノールを0.5～2mL添加して、抽出物を溶解します。さらに同容量の15％水酸化カリウム水溶液を添加混合します。
Step 9）	37℃にて30分間インキュベートします。
Step 10）	メタノール濃度が5％以下となるように、pH3 waterを添加し、そのまま固相抽出を行います。

組織サンプルの加水分解処理
Step 1）	Folch試薬を調製します。クロロホルムとメタノールを2：1混合し、BHTを 5mg/100mL溶解します。
Step 2）	50mLの平底チューブにFolch試薬 20mLを入れ、氷冷しておきます。
Step 3）	組織0.5～1gを秤量し、添加、ボルテックスにて1分間攪拌します。
Step 4）	ホモジナイザー又はソニケーターを用いて30秒間破砕処理をします。
Step 5）	窒素ガス下にて時々攪拌しながら、室温にて1時間静置します。
Step 6）	生理食塩水（0.9％ NaCl）を 4mL添加します。
Step 7）	よく攪拌し、2～3分間遠心します。
Step 8）	上層（メタノール/生理食塩水）を捨てます。
Step 9）	蛋白質層が混入しないように気をつけながら、下層を50mLチューブに回収します。
Step 10）	窒素ガス下にて乾固させ、BHT（5mg/100mL）を含むメタノール 2～4mLを添加、溶解し、さらに同容量の15％水酸化カリウム水溶液を添加します。
Step 11）	37～40℃のウォーターバスにて30分間インキュベートします。
Step 12）	メタノール濃度が5％以下となるようにpH3 water（40～80mL）を添加し、そのまま固相抽出を行います。

【ご注意】本製品は研究用試薬です。研究以外の用途（臨床検査/診断/医療行為等）には使用できません。