酸化ストレスマーカー：ニトロチロシン測定キット 3-nitrotyrosine ELISA 【日本老化制御研究所】酸化ストレスマーカー/NO stress

Rev.140714

ニトロチロシン測定キット
Nitrotyrosine ELISA

（酸化ストレス研究用試薬）

【数多くの疾病に関連するNOストレスマーカー】

　一酸化窒素（NO）は生体内において重要な生理機能を担う一方、NOはスーパーオキサイド（O₂^-）と反応することでパーオキシナイトライト（Peroxynitrite: ONOO^-）を形成し、活性窒素種（Reactive nitrogen species: RNS）として細胞や組織の障害に深く関わっていることが明らかにされつつあります。

ニトロチロシン(3-nitrotyrosine: 3-NT)は、パーオキシナイトライトによる主要なタンパク質ニトロ化修飾物の一つであり、ニトロ化ストレス(nitrosative stress)マーカーとして広く用いられています。これまでにアルツハイマー、パーキンソン氏病、多発性硬化症、脳卒中などの神経疾患をはじめ、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠動脈疾患、高血圧症など数多くの疾患との関連性が報告されています。

本キットはサンドイッチELISA法によりニトロシル化修飾タンパク質を測定します。

【製品仕様】

● 測定対象：	血清または血漿
● 特異性：	ニトロシル化修飾タンパク質
● 測定レンジ：	2～1500 nM
● 所要時間：	約4時間
● サンプル所要量：	100μL/well
● テスト数：	N=2のとき80サンプル（96ウェル x 2枚）
● 必要な器具：	ピペットおよびチップ（50～1000μL可変容量）、蒸留水、ポリプロピレン製試験管、マイクロプレートリーダー（測定波長450nm）
● 保存条件：	冷蔵（2～10℃ ・凍結不可）

品名	商品コード	測定波長	価格（税込）
ニトロチロシン測定キット	KNT-002W	450nm	154,000円

【ご注意】本製品は研究用試薬です。研究以外の用途（臨床検査/診断/医療行為等）には使用できません。

【キットの構成】

1.	マイクロプレート	96wells x 2枚（分割式）
2.	スタンダード	4本（1500 nM）
3.	サンプル希釈液（x10濃縮）	15mL
4.	標識抗体（x100濃縮ビオチン標識-抗ニトロチロシン抗体）	2本
5.	HRPコンジュゲート（HRP標識-ストレプトアビジン）	1本　使用当日に調製します。
6.	TMB基質液	22mL　そのまま使用します。
7.	反応停止液	22mL　そのまま使用します。
8.	洗浄液（x40濃縮）	30mL
9.	プレートシール	4枚

【測定手順】

1.	使用する試薬を常温に戻しておきます。
2.	使用するウェルをフレームに取付け、残ったウェルは袋に密閉し冷蔵保管します。
3.	試薬を調製します。洗浄液、希釈液、標識抗体、HRPコンジュゲートは必要量のみ希釈して調製します。
4.	スタンダードを調製します。
5.	サンプルを用意し、必要に応じて希釈します。
6.	調製したスタンダードまたはサンプルを100μL/ウェル分注します。
7.	プレートシールでウェルを密閉し、室温にて1時間インキュベートします。
8.	液を捨て、希釈済み洗浄液 200μL/ウェルを入れ20秒待ち排液。4回洗浄します。
9.	希釈済み標識抗体試薬を100μL/ウェル分注します。
10.	プレートシールでウェルを密閉し、室温にて1時間インキュベートします。
11.	液を捨て、希釈済み洗浄液 200μL/ウェルを入れ20秒待ち排液。4回洗浄します。
12.	希釈済みHRPコンジュゲート試薬を100μL/ウェル分注します。
13.	プレートシールでウェルを密閉し、室温にて1時間インキュベートします。
14.	液を捨て、希釈済み洗浄液 200μL/ウェルを入れ20秒待ち排液。4回洗浄します。
15.	TMB試薬を100μL/ウェル分注します。
16.	プレートシールでウェルを密閉し、室温にて20～30分インキュベートします。
17.	反応停止液を100μL/ウェル分注します。
18.	450nmにおける吸光度を測定し、検量線を用いてニトロチロシン濃度を算出します。

【参考文献】

1)	Protein 3-Nitrotyrosine in Complex Biological Samples: Quantification by High-Pressure Liquid Chromatography/Electrochemical Detection and Emergence of Proteomic Approaches for Unbiased Identification of Modification Sites. Tal Nuriel, Ruba S. Deeb, David P. Hajjar, and Steven S. Gross: Methods Enzymol 441,p1-17(2008)
2)	Nitrotyrosine in plasma of celiac disease patients as detected by a new sandwich ELISA. Steege JC, Koster-Kamphuis L, van Straaten EA, Forget PP, Buurman WA. Free Radic Biol Med 25(8), p953-963 (1998)