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こちらでは酸化ストレスマーカーの技術情報、学術情報をご紹介しております。皆様のご研究に役立てて頂ければ
幸いです。
またよろしければ、学会や論文等で発表された内容をご紹介頂ければ大変ありがたく思います。このページの一番下に
お問い合わせフォームをご用意いたしました。ご質問・コメントなどお気軽にお送り頂けると助かります。
対象となるマーカーも徐々に増やしていきたいと思います。どうぞよろしくお願い申し上げます。
弊社は本ホームページおよび製品、添付文書等を作成するにあたり細心の注意を払っておりますが、これらによる損害が万一発生した場合でも、
弊社は責を負いませんので予めご了承ください。また、製品の価格、仕様、試薬構成、測定手順等は、製造元の都合により予告無く変更される
場合があります。 |
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上記以外のマーカーにつきましてはこちらをクリックしてください。
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| New/高感度 8-OHdG Check |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
適用可能な動物種 |
Q：このELISAキットの測定対象動物は何ですか？
A：ヒト・マウス・ラット・スナネズミ・ウサギ・イヌ・ウシ・ウマなど殆どの動物種に適用可能です。
細胞や不溶物を必ず除去してから測定してください。尿サンプルの場合には出来ればPBSで数倍～10倍程度に希釈してから
測定すると良好な結果が得られます。尿サンプルには「New 8-OHdG Check」が適しています。血清や血漿の場合には
前処理をしてから「高感度8-OHdG Check」にて測定します。 |
| 2 |
サンプル希釈剤 |
Q：サンプルの希釈液には何を用いたら良いのでしょうか？
A：生理的リン酸緩衝液（PBS）が最適です。ヒト尿の場合は「New 8-OHdG Check」では原液のまま
測定可能ですが患者尿や、摂取試験等を実施されている場合にはPBSにて2～4倍して測定されることをお奨めします。 |
| 3 |
尿サンプルの保存安定性 |
Q：尿サンプルの保存方法、安定性について教えてください。
A：8-OHdGは化学的に比較的安定な物質です。尿サンプルの保存は室温で3日以内、冷蔵で1週間以内、
ただし微生物の繁殖のないことが必要です。微生物抑制のために塩酸等を添加した場合には、測定前にｐHを 中性付近に
戻してから測定してください。
凍結保存の場合は長期保存が可能です。凍結した尿サンプルを溶解すると不溶物が
析出することがあります。このような場合には軽く遠心して不溶物を必ず除去してから測定してください。
文献では-80℃保存では少なくとも2年間安定であることが示されています。
Y Yamamoto, et.al., J Occup Health 50, p366-372 (2008) |
| 4 |
測定可能なサンプル |
Q：尿や血清以外に8-OHdGを測定できますか？
A：これまでに腹水、人工透析液などに適用されています。基本的には血清の場合と同様の前処理が必要です。
また、最近では唾液中の8-OHdGへの適用例があるようです。DNAを抽出すれば末梢血白血球、精子、各種臓器、培養細胞などでも
測定可能です。
【参考文献】：
New biomarker evidence of oxidative DNA damage in whole saliva from clinically healthy and periodontally diseased
individuals. J Periodontol. 2002 May;73(5):551-4. M Takane, et. al.
歯周炎患者の治療前後における唾液中8-OHdGレベルを比較。 |
| 5 |
尿中8-OHdGの平均値
（健常ヒト） |
・濃度平均値 13.6 ng/mL（男性250名）10.3 ng/mL（女性250名）
・生成速度による補正平均値 8.6 ng/kg/h（男性250名 + 女性250名）
・クレアチニン補正平均値 8.4 ng/mg CRE
※生成速度やクレアチニンで補正をすると性別による8-OHdG差が無くなります。
【出典】：社内データ |
| 6 |
尿のサンプリング方法
（ヒト） |
随時尿の8-OHdG濃度には、個人差、日内変動、性差などが影響しますので、適切なサンプリング法と
補正によって精度の高いデータを得ることができます。 尿のサンプリング法および補正方法をまとめた資料を
ご用意しております。
⇒詳細はこちらをご参照ください。
【クレアチニン補正の注意点】：
運動と酸化ストレスとの関係を研究する場合にはクレアチニン補正は適しません。特に激しい運動を伴う場合には、
尿中8-OHdGの排出量が増加しますが、同時に尿中クレアチニン排出量も増加するためです。長距離ランナーを対象にした
2論文をご紹介いたします。
1) Effect of repeated exercise on urinary 8-hydroxy-deoxyguanosine excretion in humans.
Free Radic Res. 1997 Jun;26(6):507-14. Okamura K, et. al.
トレーニングを積んだ長距離ランナー。8日間のキャンプ前後の尿中8-OHdGを検討。
尿中8-OHdGは対照期間265.7±75.5 pmol/kg/日⇒キャンプ終了時335.6±107.4。有意差あり。
2) Habitual long-distance running does not enhance urinary excretion of 8-hydroxydeoxyguanosine.
Eur J Appl Physiol Occup Physiol. 1997;75(5):467-9. Pilger A,et. al.
長距離ランニングによる尿中8-OHdGへの影響を調査。尿中8-OHdGは0.12～6.45μmol/mol CRE。
クレアチニン補正では有意差が出ない。
【随時尿と24時間蓄尿の選択について】：
尿中8-OHdGの測定では、サンプリング方法（24時間蓄尿/随時尿）と補正法（クレアチニン補正/排出量補正）の
選択が重要とされています。例えば健常者（喫煙者/非喫煙者）を対象にした補正方法の比較試験では、下記のような
結果となっております。24時間蓄尿では有意差が検出されるケースでも、随時尿を使った測定では
有意差が検出されないことがあるようです。研究目的に応じてご検討ください。
・24時間蓄尿をクレアチニン補正： 喫煙者の尿中8-OHdGは有意に高値(p < 0.01)
・24時間蓄尿を排出量補正： 喫煙者の尿中8-OHdGは有意に高値(p < 0.05)
・随時尿をクレアチニン補正： 両群で有意差なし。
参考文献：Urinary excretion of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine measured by high-performance liquid
chromatography with electrochemical detection.
J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 778(1-2),p393-401(2002),
Pilger A, Ivancsits S, Germadnik D, Rudiger HW.
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| 7 |
ELISA法のトラブル対策 |
ELISAキット（New 8-OHdG Check）の使用上のポイントを解説した資料をご用意しております。
⇒詳細はこちらをご参照ください。 |
| 8 |
血清8-OHdGを測定するには |
血清サンプルの測定は、限外濾過フィルターを使って高分子成分を除去したのち「高感度8-OHdG Check」で
測定します。
⇒詳細はこちらをご参照ください。 |
| 9 |
採血管には何を用いたら良いでしょうか？ |
特に指定の採血管はございません。一般的に用いられている採血管で十分使用できると考えられます。
尚、私共ではニプロ ネオチューブPET（code. 30-122, 8.5mL用・凝固促進剤入り）を使用しております。注意点としましては、
採血したあと全血のまま放置すると抗酸化物質の消耗や8-OHdG上昇が起きる場合があるため、採血後20分程度で遠心を開始
（3,000rpm*15分・室温）して速やかに血清分離し、回収した血清は直ちに-20℃以下で凍結保存されることをお奨めします。 |
| 10 |
血清8-OHdG測定例
（ヒト） |
血清8-OHdGレベルは男性＞女性（有意差あり）。健常者男性では喫煙により血清8-OHdG高値。
一方で血清抗酸化物質低下。
【出典】：The relationship between smoking habits and serum levels of 8-OHdG, oxidized LDL antibodies,
Mn-SOD and carotenoids in rural Japanese residents., J Epidemiol 2003 Jan;13(1):29-37.Suzuki K, et.al. |
| 11 |
組織中の8-OHdGを測定するには |
組織／細胞サンプルの測定は、DNAを抽出して加水分解処理したのち「高感度8-OHdG Check」で測定します。
⇒詳細はこちらをご参照ください。
【ELISAキット実施例】：
Coexposure to benzo[a]pyrene plus ultraviolet A induces 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine formation in human
skin fibroblasts: preventive effects of anti-oxidant agents.
Environmental Toxicology and Pharmacology 12, p37-42, 2002 |
| 12 |
DNA抽出法について |
8-OHdG測定用にDNAを抽出する方法としてはNaI法が適しています。これはPhenol抽出等に比べ、操作中における
DNA酸化が抑えられるためです。
8-OHdG測定用のDNA抽出キット、前処理試薬が和光純薬工業（株）様より入手可能です。
・
DNAエキストラクター TISキット (code. 296-67701)
・
8-OHdG測定前処理試薬セット (code. 292-67801)
【参考文献】：DNA extractor kit WBを使った8-OHdG測定例
ML Hamilton, et.al. A reliable assessment of 8-oxo-2-deoxyguanosine levels in nuclear and mitochondrial DNA using
the sodium iodide method to isolate DNA.
Nucleic Acid Res. 29(10), p2117-2126(2001)
HJ Helbock, et. al. DNA oxidation matters: The HPLV-electrochemical detection assay of 8-oxo-deoxyguanosine
and 8-oxo-guanine. Proc Natl Acad Sci USA 95,p288-293(1998)
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| 13 |
組織中の8-OHdG測定に
必要なサンプル量は |
Q：組織/細胞中の8-OHdG測定には、どの程度のサンプルが必要ですか？
A：実験系によって異なりますが、一般的に正常組織中には正常dGに対し10-6～10-5の頻度で8-OHdGが
存在しています。「高感度8-OHdG Check」の測定レンジが0.125～10ng/mLですので、確実に検出するためにはmg/mL程度
（1検体あたり200μg/135μL）の濃度で精製DNAを準備していただくのが良いと考えられます。 |
| 14 |
組織DNA処理に必要な試薬
（Nuclease P1・アルカリホスファターゼ） |
Nuclease P1は下記メーカー様より入手できます。
和光純薬工業（株）code:145-08221 Nuclease P1 (Penicillium citrinum・500 units)
⇒
和光純薬工業（株）サイトへ
生化学バイオビジネス（株）code: 120065 Nuclease P1 (Penicillium citrinum)
⇒
生化学バイオビジネス（株）サイトへ
アルカリホスファターゼにつきましては、ウシ腸粘膜由来、大腸菌由来など各社より市販されておりますので、ご都合に合わせて
お選びください。ご使用の際には、必要量をとり1M Tris-HCl pH7.4にて200 units/0.7mL = 286 units/mLに希釈してください。
製品例： Sigma-Aldrich社 code. P6772-1KU Phosphatase alkaline ウシ腸粘膜由来
1000 units /vial 7,100JPY. Lyophilized powder. ≧2000 DEA units/mg protein.
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| 15 |
DNA測定時のアルゴン置換とは |
Q：組織からＤＮＡを抽出して8-OHdGを測定するプロトコルで、アルゴン置換とは何ですか？
A：アルゴン置換とはサンプル溶液中の酸素をアルゴンガスに置換する操作です。精製したDNAは空気中の酸素
との接触等により酸化される可能性があります。こうした実験中のアーティファクトを防ぐための予防措置です。具体的には
サンプル水溶液の入ったエッペンチューブ内にアルゴンガスを軽く吹き込んで、エッペンチューブ内の空気をアルゴンガスに
置き換える操作を行います。
ただ、DNAを抽出後速やかに実験をすれば、アルゴン置換の有無による影響は殆ど無いとされて
います（CG Fraga, et. al.: Oxidative damage to DNA during aging: 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in rat organ DNA and urine.
Proc Natl Acad Sci USA 87, p4533-4537, 1990）。 |
| 16 |
組織サンプルの前処理
（Chelex処理とは） |
精製したDNAは微量の2価金属イオンの存在下でFenton反応により酸化されることが知られています。
実験に使用する水をChelex樹脂に通すことで、2価の金属イオンを除去することができます。実験操作中の酸化を防ぎ、
より信頼性の高いデータを得るためにChelex処理をした水を使うことをお奨めします。 |
| 17 |
ウルトラフリーMCが見つかりません |
Millipore社製 ウルトラフリーMC（catalog#UFC3LGC）は製造中止となっているようです。
相当品としてMillipore社 Microcon YM-10（catalog#42407）が利用可能です。 |
| 18 |
組織サンプルの受託機関 |
Q：組織サンプルがあるのですが、細胞中の8-OHdGを測定してもらえませんか？
A：弊社では実施しておりませんが、OHG研究所（オーエッチジー研究所 TEL:093-695-3487）
までご相談ください。ホームページはこちらです。 |
| 19 |
測定可能なサンプル数 |
Q：ELISAキット1セットで何サンプル測定できますか？
A：N=3測定時で18サンプルを測定できます（54 tests）。1キットには96ウェルのマイクロプレートが1枚
入っております。
上端と下端ののウェルについては、使用可能ですが"エッジ効果"による誤差を生じやすいためにサンプル測定には
使用しないことをお奨めしております。検量線として6レベル*（N=3）を使用しますので、残り54ウェルがサンプル測定に使用
できることになります。弊社ではN=3での測定を推奨しており、54÷3＝18サンプル／キットとなります。もちろんN=1で測定される
のでしたら54サンプルの測定が可能です。また上端下端の部分につきましても他のウェルと同じように作成しておりますので、
エッジ効果による誤差が出やすいことをご承知のうえご利用ください。 |
| 20 |
検量線の計算方法 |
Q：検量線の近似関数は何が適していますか？
A：片対数（吸光度＝真数、濃度＝対数）の曲線近似であれば基本的にどのアルゴリズムでも問題なく
使用できます。特に最近のマイクロプレートリーダーには検量線計算機能を備えている機種も多くありますのでご活用ください。
また、片対数の折れ線（ジグザグ）でも十分な近似関数ができます。
お困りの場合には
検量線計算依頼フォームより、弊社までデータをお送りください。
ELISA検量線の計算ソフトウェアにつきましては、例えば下記のような製品が利用可能です。
「LS-PLATE manager2004」和光純薬工業（株）code.293-44751（Windows版）
「LS-PLATE manager2000」和光純薬工業（株）code.292-34951（Macintosh版）
⇒詳細はこちらをご覧ください。
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| 21 |
ELISAキットの分割使用について |
Q：ELISAキットは何回に分けて使えますか？
A：弊社のELISAキットは8ウェル*12本で構成されておりますので、サンプル数に合わせて分割して
ご利用いただけます。測定ごとに毎回検量線を作成する必要がありますのでご注意ください。検量線には6レベル*3＝18ウェルが
必要です。殆どのサンプルは-20℃以下で安定に保存できますので、一度にまとめて測定した方がより多くのサンプルを測定
できます。 |
| 22 |
卵巣子宮内膜症性嚢胞内容液への適用事例： |
粘液成分を遠心や濾過によって取り除いたあと、血清測定時と同じように限外濾過処理をすることで8-OHdGを
測定できると考えられます。
卵巣子宮内膜症性嚢胞：0.58 ng/mL、漿液性嚢胞腺腫：0.06 ng/mL、粘液性嚢胞腺腫：検出限界以下。
【出典】：S Fujii, 第31回 日本鉄バイオサイエンス学会 シンポジウム抄録. p9-10 (2007) |
| 23 |
マイクロプレートリーダーは何を使えば良いですか： |
450nmの吸光度を測定できる機種であれば、基本的にどのマイクロプレートリーダーでも対応可能です。
PCに接続されているタイプですと検量線計算機能が使えるので便利です。例えば下記の機種はPC付きで比較的安価にて
入手可能です。
機種例：「吸光マイクロプレートリーダー サンライズリモート」 和光純薬工業（株）
Code. 523-79691⇒詳細は
こちらをご覧ください。
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| 24 |
Nuclease P1の替わりにDNaseⅠを使った
DNA加水分解プロトコル： |
8-OHdG測定のためのDNA加水分解にはNuclease P1を使った加水分解法をお奨めしておりますが、
DNase Ⅰを使った加水分解法も知られております。
【DNA中の8-OHdG測定のための加水分解プロトコル】
1) 抽出乾固させたDNAに2mM CaCl2溶液100μLを添加して溶解。
2) DNase Ⅰ(4U), phosphodiesterase Ⅰ(0.0032U), phosphodiesterase Ⅱ(0.08U), alkaline phosphatase (34U)を添加し、
37℃6時間インキュベート
3) 冷エタノール250μL（-20℃）を添加し、-20℃にて30分間静置
4) 15000Gにて30分間遠心し、上清を回収、減圧乾燥させる
5) 100μL蒸留水にて溶解し、15000Gにて30分遠心、透明な上清を回収し、8-OHdG測定
出典：Measurement of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in DNA by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry:
comparison with measurement by gas chromatography-mass spectrometry.Nucleic Acids Res 29(3) E12(2001).
Dizdaroglu M, Jaruga P, Rodriguez H
【上記の加水分解プロトコルを用いて弊社ELISAキットで測定した例】
Increased mitochondrial DNA damage and down-regulation of DNA repair enzymes in aged rodent retinal pigment
epithelium and choroid. Mol Vis 14 p644-651(2008)Wang AL, Lukas TJ, Yuan M, Neufeld AH.
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| 25 |
副波長の設定について： |
副波長を設定する場合には600～650nmを使用します。
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よろしければ質問・コメント・研究事例などお寄せください。 |
| 【参考文献】 |
| 1) |
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Protective role of dietary anti-oxidants in oxidative stress.
Oxidative Stress and Aging (Esd:R.G.Cutler, L.Packer, Bertram and A.Mori) p367-377, Birkhser Verlag Basel, Switzerland (1995) |
| 2) |
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Analysis of a form of oxidative DNA damage, 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine, as a marker of cellular oxidative stress during
carcinogenesis.
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| 3) |
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| 4) |
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DNA中の8-OHdGを、HPLC-ECD法とELISA法で測定した場合、高い相関性を示すことが報告されています（r2 =0.958）。
|
| 12) |
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Carcinogenesis 24(2), p235-241 (2003)
培養細胞を対象に8-OHdGを測定されています。対照（約0.3 ng/10EXP6 cells）に対し、酸化ストレス負荷した細胞では
約0.5 ng/106 cellsに上昇することが報告されています。 |
| 27) |
Nagayoshi Y, Kawano H, Hokamaki J, Miyamoto S, Kojima S, Shimomura H, Tsujita K, Sakamoto T,
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Urinary 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine levels increase after reperfusion in acute myocardial infarction and may predict
subsequent cardiac events.
Am J Cardiol. 95(4), p514-517 (2005)
急性心筋梗塞患者における酸化ストレスの経時変化を尿中8-OHdGを用いて評価。再灌流療法開始後4時間で尿中8-OHdGは
ピークを示す。再灌流療法前後での尿中8-OHdGレベルはnoncardiac event群よりもcardiac event群が有意に高値を示しており、
尿中8-OHdGレベルがcardiac eventの予測因子となりうることが示唆されています。 |
| 28) |
Yutaka Otsuji, Eiji Kuwahara, Keiko Yuge, Goichi Yotsumoto, Takayuki Ueno, Kenichi Nakashiki,
Shuichi Hamasaki, Sadatoshi Biro, Shinichi Minagoe, Robert A. Levine, Ryuzo Sakata, and Chuwa Tei:
Relation of Aneurysmectomy in Patients With Advanced Left Ventricular Remodeling to Postoperative Left Ventricular Filling Pressure,
Redilatation With Ischemic Mitral Regurgitation.
Am J Cardiol 95, p517-521 (2005)
急性心筋梗塞患者では尿中8-OHdGが高値を示します（25.4±3.8 ng/mg CRE）。再灌流療法の開始後4時間でピーク
（49.3±6.2 ng/mg CRE）を示し、24時間後には対照レベルにまで低下することが報告されています。 |
| 29) |
Someya T, Kaneko K, Yamada T, Yamashiro Y.:
Effect of a novel free radical scavenger, edaravone, on puromycin aminonucleoside induced nephrosis in rats.
Pediatr Nephrol.20(10):1430-1434(2005)
ラット（Wistar-Kyoto rat）にpuromycin-aminonucleoside (PAN) 投与し、抗酸化剤エダラボン（EDA）の効果を検証。
エダラボン投与群の尿中8-OHｄGはエダラボン非投与群に比べ低値を示します。 |
| 30) |
Watanabe E, Matsuda N, Shiga T, Kajimoto K, Ajiro Y, Kawarai H, Kasanuki H, Kawana M:
Significance of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine levels in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy.
J Card Fail. 2006 Sep;12(7):527-32. (Journal of cardiac failure)
idiopathic dilated cardiomyopathy (DCM)患者32名の血清8-OHdGとチオレドキシン（TRX）をELISA法にて測定。
血清8-OHdGはDCM患者の心不全重傷度に相関して高値を示す。 |
| 31) |
Morillas-Ruiz J, Zafrilla P, Almar M, Cuevas MJ, Lopez FJ, Abellan P, Villegas JA, Gonzalez-Gallego J:
The effects of an antioxidant-supplemented beverage on exercise-induced oxidative stress: results from a placebo-controlled
double-blind study in cyclists
Eur J Appl Physiol. 2005 Aug 31:1-7
自転車競技選手に対する抗酸化サプリメント飲料の試験。2重盲検スタディ。
運動開始15分前に30ｍL/kgのサプリメント飲料投与(抗酸化力0.41mM Trolox相当）。尿中8-OHdGはプラセボ群に対し21％低下。 |
| 32) |
Shiihara T, Kato M, Ichiyama T, Takahashi Y, Tanuma N, Miyata R, Hayasaka K:
Acute encephalopathy with refractory status epilepticus: Bilateral mesial temporal and claustral lesions, associated with
a peripheral marker of oxidative DNA damage
J Neurol Sci. 250(1-2):159-61(2006)
急性脳症患者のCSF(cerebro spinal fluid)、血漿および尿中の8-OHdGを測定されています。 |
| 33) |
Roberto Cangemi, Francesco Angelico, Lorenzo Loffredo, Maria Del Ben, Pasquale Pignatelli,
Alessandra Martini and Francesco Violi:
Oxidative stress-mediated arterial dysfunction in patients with metabolic syndrome: Effect of ascorbic acid.
Free Radical Biology and Medicine 43(5), p853-859 (2007)
メタボリックシンドローム（MS）群の血清8-OHdGは健常者対照に比べ高値を示します。 |
| 34) |
Tomasz Dziaman, Daniel Gackowski, Rafal Rozalski, Agnieszka Siomek, Jaroslaw Szulczynski,
Romuald Zabielski, Ryszard Olinski:
Urinary excretion rates of 8-oxoGua and 8-oxodG and antioxidant vitamins level as a measure of oxidative status
in healthy, full-term newborns.
Free Radical Research, 41(9), p997-1004(2007)
新生児の尿中8-OHdGは成人の約2.5倍を示します。尿中8-OHdGおよび8-oxoGuaは 新生児における酸化ストレスの
良い指標となるうることが報告されています。 |
| 35) |
Olga Espinosa, Jorge Jimenez-Almazan, Felipe J. Chaves, M. Carmen Tormos, Sonia Clapes,
Antonio Iradi, Amparo Salvador, Marta Fandos, Josep Redon, Guillermo T. Saez:
Urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG), a reliable oxidative stress marker in hypertension.
Free Radical Research 41(5), p546-554 (2007)
高血圧症患者の尿中8-OHdGが治療に伴い低下することが報告されています。 |
| 36) |
Parul R Patel, Ruth J Bevan, Nalini MIstry, Joseph Lunec:
Evidence of oligonucleotides containing 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in human urine.
Free Radical Biol Med 42, p552-558(2007)
尿中8-OHdGは遊離型だけでなく、オリゴヌクレオチドの形で8-OHdGが含まれることが報告されています。 |
| 37) |
Thompson HJ, Heimendinger J, Haegele A, Sedlacek SM, Gillette C, O'Neill C, Wolfe P, Conry C:
Effect of increased vegetable and fruit consumption on markers of oxidative cellular damage.
Carcinogenesis.20(12),p2261-2266(1999)
野菜と果物の摂取試験（12サービング/日*14日間）において尿中8-OHdG濃度が49.6±12.4⇒21.4±2.2 ng/mg CREに低下すること、
末梢血白血球中の8-OHdGレベルも7.9±1.2⇒6.2±0.8/106dGに低下することが報告されています。 |
| 38) |
Reiko Nagasaka, Nobuaki Okamoto, Hideki Ushio:
Effects of caloric restriction on post-spawning death of ayu.
Exp Gerontol 40, p556-561(2005)
魚（鮎）の脳および肝臓における8-OHdGレベルが報告されています。 |
| 39) |
Nakano M, Onodera A, Saito E, Tanabe M, Yajima K, Takahashi J, Chuyen NV:
Effect of Astaxanthin in Combination with alpha-Tocopherol or Ascorbic Acid against Oxidative Damage in Diabetic ODS Rats.
J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 54(4)p329-334 (2008)
抗酸化物質アスタキサンチンの糖尿病ラットにおける研究例。アスタキサンチン+αトコフェロール投与群において
尿中8-OHdGが有意に低下。 |
| 40) |
Ogawa S, Mori T, Nako K, Ito S:
Combination therapy with renin-angiotensin system inhibitors and the calcium channel blocker azelnidipine decreases plasma
inflammatory markers and urinary oxidative stress markers in patients with diabetic nephropathy.
Hypertens Res 31(6)p1147-1155(2008)
高血圧症の糖尿病性腎症患者に対し、レニン-アギオテンシン系抑制条件下にてCaチャネルブロッカー（azelnidipine）を投与。
投与前後で尿中8-OHdGが有意に低下（8.0 ⇒7.1 ng/mgCRE）。 |
| 41) |
Yasuda M, Ide H, Furuya K, Yoshii T, Nishio K, Saito K, Isotani S, Kamiyama Y, Muto S, Horie S:
Salivary 8-OHdG: a useful biomarker for predicting severe ED and hypogonadism.
J Sex Med. 5(6),p1482-1491(2008)
唾液中の8-OHdG濃度は中年男性の重度のEDおよび性腺機能低下の有用なバイオマーカーになり得ることが
示唆されています。 |
| 42) |
Tamura H, Takasaki A, Miwa I, Taniguchi K, Maekawa R, Asada H, Taketani T, Matsuoka A, Yamagata Y,
Shimamura K, Morioka H, Ishikawa H, Reiter RJ, Sugino N:
Oxidative stress impairs oocyte quality and melatonin protects oocytes from free radical damage and improves fertilization rate.
J Pineal Res 44(3)p280-287(2008)
濾胞液を対象とした研究例です。 |
| 43) |
Sakamoto Y, Ishikawa T, Kondo Y, Yamaguchi K, Fujisawa M:
The assessment of oxidative stress in infertile patients with varicocele.
BJU Int. 101(12)p1547-1552(2008)
不妊症男性患者（無精子症および精子減少症）の精漿中8-OHdG濃度の測定例です。 |
| 44) |
Tanuma N, Miyata R, Hayashi M, Uchiyama A, Kurata K:
Oxidative stress as a biomarker of respiratory disturbance in patients with severe motor and intellectual disabilities.
Brain Dev. 30(6)p402-409(2008)
重症心身障害患者の尿中8-OHdG濃度（18.8 ± 9.0 ng/mg Cre）は健常対照（10.5 ± 2.9 ng/mg Cre）に比べ有意に高値。
また、尿中8-OHdG濃度は呼吸異常の重症度と正の相関示すことが報告されています。 |
| 45) |
Kageyama Y, Takahashi M, Nagafusa T, Torikai E, Nagano A:
Etanercept reduces the oxidative stress marker levels in patients with rheumatoid arthritis.
Rheumatol Int. 28(3)p245-251(2008)
関節リウマチ患者22名を対象に、TNF-α阻害剤Etanerceptを投与。尿中8-OHdGは治療開始後6ヶ月で低下。 |
|
 |
| 抗8-OHdGモノクローナル抗体 |
| No. |
【タイトル】 |
【内容】 |
| 1 |
適用可能な動物種 |
ヒト、ウサギ、ラットなど幅広い動物種に適用可能です。
マウス組織への適用の際には、組織サンプル由来のマウスIgGへの対策が必要です。
具体例としましてVector社Vector M.O.M. Immunodetection kit (フナコシより入手可能)が利用できます。マウス心臓血管などで
低バックグラウンドの良好な染色像が得られたとの情報をいただいております。内在性ペルオキシダーゼによる
バックグラウンドが問題となるケースでは、アルカリホスファターゼによる発色系をお奨めします。 |
| 2 |
免疫組織染色プロトコル |
⇒詳細はこちらをご参照ください。
また、8-OHdGの免疫組織染色につきましては、「酸化ストレスマーカー」学会出版センター(2005年)
p256-260「発癌における核酸修飾」豊國伸哉著 に詳しい解説があります。 |
| 3 |
免疫組織染色の条件設定 |
Q：8-OHdGの免疫組織染色で気をつけるポイントは何かありますか？
A：対象となる組織サンプルの種類や状態によって、染色条件を調整の調整が必要な場合があります。
正常な細胞でも10-6/dGオーダーの8-OHdGが存在しており、多くの研究例では酸化ストレスの亢進によって
これが数割～数倍増加します。サンプル組織と比較対照との差異が大きくない場合には、1次抗体濃度など染色条件を
最適化する必要があります。
また、過酸化水素やUVなどヒドロキシラジカルを発生する条件下では、
正常dGが酸化されて8-OHdGが新たに生成される場合があります。過酸化水素による内因性ペルオキシダーゼ不活化処理は
お避けください。アルカリホスファターゼ系による染色をおすすめします。 染色される部位は主に細胞核です。 |
| 4 |
免疫組織染色の受託機関 |
Q：組織サンプルがあるのですが、免疫組織染色を実施してもらえませんか？
A：（株）バイオ病理研究所（TEL: 0978-72-0454）にて実施しております。ご相談ください。
⇒ホームページはこちらです。 |
| 5 |
培養細胞の染色 |
Q：培養細胞を染色する際に、抗原賦活化処理によって細胞が剥がれてしまうのですが？
A：細胞の種類等、実験条件によっては細胞が剥がれやすいケースがあるようです。 このような場合には固定法として
ホルマリン固定ではなくブアン固定（Bouin fixation）をお奨めいたします。ブアン固定の場合には、抗原賦活化処理が
必要ありませんので、サンプル剥離の可能性が低くなると期待されます。 |
| 6 |
内因性ビオチンのブロッキング |
腎臓、肝臓、前立腺、腸においては内因性ビオチンのブロッキングが必要となる場合があります。
このような場合には、1次抗体反応の前にブロッキングを実施してください。
1) 0.001% avidin / PBSにて10～15分インキュベート
2) PBSにて洗浄
3) 0.001% biotin / PBSにて10～15分インキュベート
4) PBSにて洗浄 |
| 7 |
凍結切片への適用 |
凍結切片でも染色できる可能性はあると考えられますが、具体的な染色例の情報はありません。 |
| 8 |
蛍光標識での検出例
（マウス網膜組織・テキサスレッド） |
1) 内因性ビオチンのブロッキング(Vector社)
2) 内因性マウスIgGブロッキング(Vector社 MOM kit)
3) 抗8-OHdG抗体（5μg/mL,室温30分）
4) ビオチン標識-抗マウスIgG (室温10分)
5) テキサスレッド-アビジン (10μg/mL)
参考文献：Fujihara et.al., PLoS ONE 3(9),e3119 (2008) |
| 9 |
蛍光標識での検出例
（ヒト培養細胞・Fluor488） |
1) 4％ paraformaldehyde固定
2) RNase 100μg/mL, 10mM Tris-HCl pH7.5, 1mM EDTA, 0.4M NaClにて37℃1時間
3) Proteinase K 10μg/mLにて室温7分
4) 4N HClにて室温7分
5) 0.2% Triton X/ PBSにてリンス
6) 抗8-OHdG抗体(1:50)
7) Fluor488標識-抗マウスIgG ヤギ抗体(1:200)
参考文献：Lee YA, at. al.,Biol Pharm Bull 31(6)p1265-1269(2008)
この文献では酸化ストレス負荷は300μM H2O2にて2時間処理しています。 |
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よろしければ質問・コメント・研究事例などお寄せください。 |
| 【参考文献】 |
| 1) |
T.Tanaka, Y.Nishiyama, K.Okada, K.Hirota, M.Matsui, J.Yodoi, H.Hiai, and S.Toyokuni:
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| 2) |
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| 3) |
S.Toyokuni, T.Tanaka, Y.Hattori, Y,Nishiyama, A.Yoshida, K.Uchida, H.Hiai, H.Ochi, and T.Osawa:
Quantitative immunohistochemical determination of 8-hydroxy-2'deoxyguanosine by a monoclonal antibody N45.1: Its application
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| 4) |
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Reactive oxygen species-induced molecular damage and its application in pathology.
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An in vitro Feton reaction model and the application of immunohistochemistry to detect oxidative damage.
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Edaravone reduces early accumulation of oxidative products and sequential inflammatory responses after transient
focal ischemia in mice brain.
Stroke. 36(10):p2220-2225(2005)
マウスに対し60分間虚血⇒再灌流処置。再灌流開始24ｈ/72ｈ/7日後の8-OHdGを免疫組織染色にて測定。
エダラボン投与penumbra部における8-OHdGは減少。 |
| 15) |
S Akatsuka, TT Aung, KK Dutta, L Jiang, HW Lee, YT Liu, J Onuki, T Shirase, K Yamasaki,
H Ochi, Y Naito, T Yoshikawa, H Kasai, Y Tominaga, K Sakumi, Y Nakabeppu, Y Kawai, K Uchida, A Yamasaki, T Tsuruyama,
Y Yamada and S Toyokuni:
Contracting genome-wide distribution of 8-hydroxyguanine and acrolein-modified adenine during oxidative stress
induced renal carcinogenesis.
Am. J. Pathol. 169(4), p1328-1342 (2006) |
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Subrata K. Biswas, Jose B. Lopes De Faria:
Which comes first: Renal inflammation or oxidative stress in spontaneously hypertensive rats?
Free Radical Research, 41(2), p216 -224(2007)
SHR高血圧ラットを対象に腎臓中の8-OHdGを免疫組織染色にて検出。3週齢で8-OHdG陽性細胞が増加。 |
| 17) |
JUN YAMAKOSHI, FUJIO OTSUKA, ATSUSHI SANO, SHOICHI TOKUTAKE, MAKOTO SAITO, MAMORU KIKUCHI and
YOSHIRO KUBOTA:
Lightening Effect on Ultraviolet-Induced Pigmentation of Guinea Pig Skin by Oral Administration of a Proanthocyanidin-Rich
Extract from Grape Seeds.
Pigemt Cell Res 16, p629-638(2003)
モルモット皮膚における染色例です。UV照射により8-OHdG陽性細胞が増加しますがグレープシードエキス投与により
8-OHdG陽性細胞の増加が抑制されることが報告されています。 |
| 18) |
T. Ichiseki, A. Kaneuji, S. Katsuda1, Y. Ueda,T. Sugimori and T. Matsumoto:
DNA oxidation injury in bone early after steroid administration is involved in the pathogenesis of steroid-induced osteonecrosis.
Rheumatology 44,p456-460(2005)
ウサギにおける染色例です。DAKO社 EnVision(TM)が利用されています。 |
| 19) |
Nakajima Y, Inokuchi Y, Shimazawa M, Otsubo K, Ishibashi T, Hara H:
Astaxanthin, a dietary carotenoid, protects retinal cells against oxidative stress in-vitro and in mice in-vivo.
J Pharm Pharmacol. 60(10), p1365-1374(2008)
抗酸化物質アスタキサンチンのマウスにおける研究例です。 |
| 20) |
Fujihara M, Nagai N, Sussan TE, Biswal S, Handa JT:
Chronic cigarette smoke causes oxidative damage and apoptosis to retinal pigmented epithelial cells in mice.
PLoS ONE. 3(9) e3119(2008)
マウス網膜色素上皮細胞の染色例です。テキサスレッドを使った蛍光標識で検出されています。 |
| 21) |
Lee YA, Cho EJ, Yokozawa T:
Protective effect of persimmon (Diospyros kaki) peel proanthocyanidin against oxidative damage under H2O2-induced cellular senescence.
Biol Pharm Bull 31(6)p1265-1269(2008)
ヒト繊維芽細胞を使った研究例です。300μM 過酸化水素にて2時間刺激した細胞を対象に、プロアントシアニジンによる
保護作用を検証しています。検出にはFluor488を使った蛍光標識が用いられています。 |
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